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INTRODUCCIÓN
La microbiota extremofila conforma una población de microorganismos muy diversos, cuya característica más importante es la de poseer condiciones óptimas para su desarrollo muy diferentes a las que poseen los microorganismos considerados como normales, por ejemplo, crecer a valores altos o bajos de temperatura y pH, crecimiento en aguas con alta salinidad y presión osmótica, presencia en ambientes con alta presión y radiación, entre otros. Muchos de estos organismos se encuentran dentro de los dominios Archaea y Bacteria, donde se incluyen una gran variedad de microorganismos capaces de vivir en condiciones ambientales extremas [1].
En los últimos años el interés por los microorganismos extremofilos se ha incrementado debido a que como parte del acervo genético y metabólico se han descrito un gran número de moléculas con actividades muy diversas (metabolitos secundarios, antibióticos, enzimas, etc.) capaces de realizar sus funciones en condiciones extremas, las cuales en muchos casos son comparables a las que ocurren en los procesos industriales y ambientales, haciendo que estas moléculas y/o los microorganismos que las poseen puedan ser utilizados como herramientas de aplicación industrial y ambiental [2,3].
No obstante también ha despertado interés desde el punto de vista sanitario, la posibilidad de que estos microorganismos puedan constituir un reservorio natural de genes de resistencia a antibióticos (Resistomas) los cuales pueden ser trasladados por procesos como la conjugación a los microorganismos patógenos que pudieran llegar de manera circunstancial a las fuente termales, transformándose entonces en un problema de salud debido a que podrían generar el surgimiento de resistencia a antibióticos, en microorganismos de importancia sanitaria presente en estos ambientes [4].
Este hecho es muy importante, debido a que estos lugares son muy frecuentados por personas con problemas de salud, quienes asisten a estos lugares en busca de alivio a sus dolencias, sin embargo lejos de obtener su objetivo pueden ser infectados por microorganismos patógenos trasmitidos por otras personas los cuales al interactuar con la microbiota residente que posee genes de resistencia de manera natural, pudieran incrementar o modificar su estructura genética adquiriendo nuevos genes, lo cual podría complicar los tratamientos.
En atención a lo mencionado, y al hecho de que a pesar de que Ecuador posee una gran cantidad y variedad de fuentes termales, las cuales son utilizadas con fines terapéuticos y recreacionales por una gran cantidad de personas, existen muy pocos estudios microbiológicos y de presencia de resistomas ambientales en este tipo de agua. Por ello, se planteó el presente trabajo de investigación, que constituye el primer trabajo microbiológico realizados para estos manantiales, cuyo objetivo fue realizar un estudio de la microbiota presente en las fuentes termales del Balneario Termas la Merced, ubicado en las cercanías de la Ciudad de Quito, Ecuador, con el fin de aislar e identificar las bacterias autóctonas de estas aguas, y posteriormente determinar los patrones de resistencia a antibióticos de las mismas, de manera de conocer la diversidad de la microbiota bacteriana extremofila y si estos ecosistemas actúan como resistomas ambientales.
MATERIAL Y MÉTODOS
En el presente trabajo se utilizó el diseño de estudios descriptivos observacionales no experimentales para investigaciones en el área de la Microbiologia,
Toma de las muestras
Se analizaron un total de 10 muestras de agua termal procedentes del Balneario Termas la Merced, ubicado en las cercanías de la Ciudad de Quito, Ecuador, tanto de la zona de emergencia del manantial termales (5 muestras), como en las piscinas utilizadas por los bañistas (5 muestras). Las muestras de agua fueron recolectadas de manera aséptica durante los meses de julio a diciembre del año 2015, utilizando recipientes de plástico estériles de 150 mL. Las mismas fueron trasladadas en contenedores de anime para mantener la temperatura de la fuente durante el transporte a los laboratorios de microbiología de la Facultad de Ciencias de la ESPOCH donde se realizaron los análisis microbiológicos, en un periodo no mayor de 24 horas luego de su recolección [4, 5, 6].
Análisis microbiológico
Se realizó la siembra y aislamiento bacteriano utilizando las placas de cultivo PetrifilmTM, según el protocolo sugerido por el fabricante, incubando las placas de Petrifilm a una temperatura de 35° C, durante un periodo de 48 a 72 horas [5].
Selección y purificación de las colonias bacterianas aisladas
De las bacterias crecidas en las placas Petrifilm, se seleccionaron al menos un representante de cada uno de los tipos de colonias obtenidas, de acuerdo a las características macroscópicas exhibidas, y se inocularon en cajas Petri con agar Mueller Hinton, incubando durante 24 horas a 35 °C. El proceso de repique se repitió al menos tres veces para obtener un aislado bacteriano estable, posteriormente estos aislados fueron sometidos a un re-aislamiento para obtener clones puros, aplicando la técnica de siembra por agotamiento [6].
Identificación de los aislados bacterianos
Sobre las colonias bacterianas aisladas y purificadas, se procedió a realizar la tinción de Gram, la prueba de la oxidasa, catalasa, así como una serie de pruebas fisiológicas y bioquímicas para cada tipo de bacterias aisladas [7,8] de manera de poder identificarlas, de ser posible, hasta el nivel de especie y en los casos en que fue necesario se realizó su identificación utilizando el sistema de identificación bacteriano MicrogenTM GN-ID [6, 7, 8]
Determinación del perfil de susceptibilidad a diversos antibióticos
Sobre cada una de los clones bacterianos identificados, se determinaron los perfiles de susceptibilidad a diversos antibióticos utilizando el método de Kirby Bauer de difusión en Agar Mueller Hinton [9] con la ayuda de discos de diversos tipos de antibióticos: Ampicilina (AM) 10µg; Amoxicilina/ácido clavulánico (AMC) 20/10µg; Cefalotina (KF) 30µg; Ceftriaxona (CRO) 30µg; Oxacilina (OX) 1µg; Ciprofloxacina (CIP) 5µg; Eritromicina (E) 15µg; Gentamicina (CN) 10µg; Imipenem (IPM) 10µg; Meropenem (MEN) 10µg; Penicilina (P) 10U; Trimetoprim/sulfametoxazol (STX) 1.25/23.75 µg.
La metodología que se siguió fue la indicada por Flores y colaboradores (2010), en donde se utilizaron placas de Agar Mueller Hinton, las cuales fueron inoculadas con suspensiones de cada una de los aislados bacterianos ajustando la turbidez a 0,5 Macfarlán (1.5x108 UFC/mL), para lo cual se utilizó un hisopo estéril. Se dejó secar el inóculo por 5 minutos y se colocaron los discos de antibióticos sobre el agar utilizando pinzas estériles. Posteriormente las placas se incubaron a 35ºC durante 48 horas, al cabo de las cuales se procedió a determinar la presencia o ausencia de halos de inhibición [10].
RESULTADOS
Bajo las condiciones de muestreo utilizadas en el presente estudio, las muestras de agua del balneario Termas la Merced, tomadas en la zona de emergencia del manantial, no mostraron ningún crecimiento bacteriano.
Por el contrario, a partir de las muestras de agua tomada de las piscinas utilizadas por los bañistas, se pudo aislar e identificar un total de 13 clones bacterianos (Tabla 1) de los cuales el mayor número correspondió a la especie bacteriana Brevundimonas diminuta con cuatro aislados identificados, seguida por las especies Aeromonas schubertii y Budvicia aquatica, con dos aislados cada una, seguidas por las especies Acinetobacter haemolyticus, Bacillus spp, Citrobacter amalonaticus, Pseudomonas stutzeri y Xenorhabdus beddingii, con un aislado.
Los resultados correspondientes a los perfiles de resistencia y susceptibilidad a los antibióticos realizados a las clones bacterianos aislados e identificados se resumen en las tablas 2 y 3.
La evaluación de la resistencia a antibióticos de los asilados bacterianos mostró un comportamiento variado, aunque todos los aislados mostraron resistencia al menos a un antibiótico (Tabla 2 y tabla 3).
El mayor número de resistencias (4 antibióticos) fue encontrado para los Clones 2 y 12 de Brevundimonas diminuta que resultaron resistentes a los antibióticos Amoxicilina/ácido clavulánico, Imipenem, Cefalotina y Ampicilina, así como para la colonia de Bacillus spp (Clon 9) que resultó resistente a los antibióticos Cefalotina, Ampicilina, Penicilina y Oxacilina; los aislados Aeromonas schubertii (Clon 16) y Pseudomonas stutzeri (Clon 31) mostraron resistencia a los antibióticos Amoxicilina/ácido clavulánico, Cefalotina y Ampicilina; Brevundimonas diminuta (Clon 6) presentó resistencia a los antibióticos Amoxicilina/ácido clavulánico y Cefalotina; los restantes 7 clones mostraron resistencia solo a Cefalotina
Todos los aislados fueron sensibles a los antibióticos Trimetoprim/sulfametoxazol, Gentamicina y Ceftriaxona, mientras que ante la Cefalotina todos los aislados bacterianos mostraron resistencia.
DISCUSIÓN
Las muestras de agua del balneario Termas la Merced, tomadas en la zona de emergencia del manantial, no mostraron ningún crecimiento bacteriano. Este tipo de resultado donde no se observa un crecimiento bacteriano puede ser debido a las extremas condiciones de temperatura y concentración de sales que tienen este tipo de agua y son similares a otros estudios de aguas termales, donde se ha señalado crecimiento bacteriano nulo o escaso crecimiento en algunos manantiales de aguas termales [11, 12, 13].
Diversos autores reportan a los géneros Aeromonas, Brevundimonas y en especial Pseudomonas, como microbiota común en estos ambientes acuáticos [13, 14, 15], resultados coincidentes con los resultados obtenidos en el presente trabajo.
La evaluación de la resistencia a antibióticos de los asilados bacterianos mostró un comportamiento variado (Tablas 2 y 3). Todos los aislados mostraron resistencia al menos a un antibiótico y se evidenció la presencia de cepas bacterianas multiresistentes al menos a 2 antibióticos, lo cual constituye un riesgo para la salud de las personas que acuden a estos manantiales por la posibilidad de infectarse con estas cepas.
Resultados similares a los encontrados en el presente trabajo, sobre todo en el caso de las bacterias de los géneros Aeromonas, Brevundimonas y Pseudomonas, han sido reportados por autores en diversos manantiales de aguas termales del mundo [4, 16, 17, 18, 19, 20].
De igual forma, los resultados muestran una gran prevalencia en estas aguas de bacterias multiresistentes a antibióticos de uso cotidiano, tanto en medicina veterinaria, como en la medicina humana, lo cual estaría indicando un uso inadecuado de antibióticos en la zona de estudio o la posibilidad de una trasferencia horizontal de genes entre bacterias patógenas que ingresan en estos ecosistemas por medio de las personas enfermas que acuden a ellas para restablecer su salud, y las bacterias autóctonas propias de estas aguas [4].
En los últimos años se ha acuñado el término de Resistomas para designar aquellos ecosistemas donde se ha generado por presión selectiva, un acumulo de genes de resistencia antimicrobiana, no está claro aún si estos Resistomas son el producto de un proceso evolutivo bacteriano, o resultado del uso indiscriminado de los antibióticos por parte de la humanidad, o de ambos procesos [21].
En todo caso, el presente trabajo evidencia la existencia de Resistomas en los manantiales de aguas termales, que debería tenerse en cuenta al momento de indicar estas aguas a pacientes con problemas inmunológicos o en tratamiento con drogas supresoras inmunológicas y que, además, estaría indicando una contaminación moderada de estas aguas. Por otra parte, se encuentra que en estos ecosistemas habita una microbiota bacteriana extremofila escasa, aunque específica, que se ha adaptado a las condiciones fisicoquímicas extremas prevalente en estas aguas [21].
CONCLUSIONES
Se detectó la presencia de una microbiota bacteriana extremofila característica, aunque escasa, lográndose aislar e identificar 13 clones bacterianos. Las especies identificadas fueron: Brevundimonas diminuta, Aeromonas schubertii, Budvicia aquatica, Acinetobacter haemolyticus, Bacillus spp, Citrobacter amalonaticus, Pseudomonas stutzeri y Xenorhabdus beddingii.
El fenómeno de multiresistencia se observó en las cepas de Brevundimonas diminuta (Resistente a 4 antibióticos), Bacillus spp (Resistencia a 3 antibióticos), Aeromonas schubertii (Resistencia 3 antibióticos) y Pseudomonas stutzeri (Resistencia a 3 antibióticos) y Brevundimonas diminuta (Resistencia a 2 antibióticos). Todos los aislados fueron sensibles a los antibióticos Trimetoprim/sulfametoxazol, Gentamicina y Ceftriaxona.
Los resultados obtenidos señalan la necesidad de realizar estudios más extensos para determinar a nivel genético los mecanismos de resistencia presente en las cepas de las especies bacterianas encontradas, así como los mecanismos de transferencia genética involucrados. De igual forma, implementar sistemas de vigilancia epidemiológica y ambiental, a través de la elaboración de mapas de riesgos para disminuir el posible impacto de estos Resistomas en el ambiente y por ende en la salud humana.
