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INTRODUCCIÓN
Los adelantos industriales y tecnológicos de las últimas décadas han ocasionado graves problemas de contaminación ambiental. Según Eróstegui (2009) las principales industrias responsables de la emisión de metales pesados al ambiente son las industrias minera, petroquímica y metalúrgica.
El suelo y el agua se ven afectados principalmente por la industria minera debido a las altas concentraciones de metales como arsénico, cadmio, cobre, cromo, hierro, plomo y selenio, generados a lo largo de sus actividades (Turcios & García, 2010). La utilización de bacterias para remediar estos ambientes contaminados y la búsqueda de una mejora continua en cada uno de los procesos mineros, son alternativas que reducirían de manera significativa los impactos ocasionados por esta industria.
Por otra parte García, Castells, & Gaya (2012) señalan que la industria petroquímica ha sido considerada como potencialmente peligrosa, debido a los graves riesgos asociados a sus actividades, accidentes de barcos petroleros de gran tonelaje y a los vertidos ocasionados por la limpieza y mantenimiento de sentinas. Entre las consecuencias directas podemos mencionar los daños a la vida marina y a los ecosistemas terrestres, los mismos que repercuten de manera negativa en las actividades económicas de las zonas afectadas (Greenpeace, 2008). En algunos casos los daños ocasionados al ambiente se pueden considerar irreversibles, es decir, cuando el daño cubre grandes extensiones de terreno y la remediación es muy complicada o costosa y afecta de manera considerable a las especies animales y vegetales, llegando inclusive a poner en riesgo su existencia.
Como lo mencionan Bustos & Garzón (2015) el sector metalúrgico tiene cuatro tipos de contaminación ambiental: emisiones atmosféricas, residuos sólidos, emisiones líquidas y ruidos. La generación de residuos sólidos para Ambuludi & Hoyos (2013) es considerada como la que mayor contaminación produce, debido a que en los diferentes procesos metalúrgicos se generan residuos de metales pesados como plomo, níquel, cobre, zinc, mercurio, arsénico y cadmio, los cuales pueden acumularse en los organismos de seres vivos.
Para mitigar los impactos ambientales ocasionados por las diferentes actividades industriales se han empleado varias técnicas de biorremediación como: la fitorremediación, que utiliza plantas para concentrar, transferir o destruir contaminantes (Volke, 2002), tal es el caso de Eichhornia crassipes, una planta acuática perenne ampliamente estudiada para ser empleada en fitorremediación ex situ, principalmente como herramienta para la limpieza efectiva de efluentes contaminados con metales pesados, plaguicidas y colorantes vertidos por varias industrias (Guevara & Ramírez, 2015); otra de las técnicas empleadas para recuperar y limpiar estos ambientes contaminados es la remediación con bacterias, la misma que según Sánchez & Rodríguez (2010) es considerada como una tecnología que utiliza el potencial metabólico de los microorganismos, específicamente su capacidad para degradar total o parcialmente una amplia gama de compuestos.
Algunos géneros de bacterias como Pseudomona, Xanthomonas, Ferroxidans, Ralstonia, Acidobacillus presentan capacidad como agentes biorremediantes, ya que éstas son capaces de extraer metales de sustratos sólidos, ser utilizadas como bioabsorbentes para la recuperación de metales y para el tratamiento de efluentes industriales (Suárez & Reyes, 2002; Torres, 2003). La capacidad del género Pseudomona para degradar compuestos tóxicos según Torres (2003) depende del tiempo de contacto con el compuesto, las condiciones ambientales y su versatilidad fisiológica, siendo considerado como uno de los géneros más eficientes al momento de degradar contaminantes.
Las características que debe tener un microorganismo para ser considerado útil a nivel industrial son producir la sustancia de interés, estar disponible en cultivo puro, debe ser genéticamente estable, crecer en cultivos a gran escala, crecer rápidamente y producir el producto deseado en cortos periodos de tiempo, crecer en un medio de cultivo barato y disponible en grandes cantidades y no debe ser patógeno (Morales, 2012).
Existen múltiples aplicaciones industriales de las bacterias, como explican Castillo & Barragán (2011) en la industria alimentaria algunas bacterias lácticas: Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Estreptococcus y Leuconostoc, pueden preservar y conservar las características organolépticas de los alimentos (Ramírez, Ulloa, Velázquez, Ulloa, & Arce, 2011); en el caso de la industria farmacéutica los géneros: Streptomyces, Bacillus, Streptomyces, se puede incorporar a principios activos para originar nuevos medicamentos y antibióticos; en la industria de plásticos y papel se desea mejorar los productos, procesos y crear nuevas tecnologías amigables con el ambiente, por ejemplo Alcaligenes puede ser utilizada en la fabricación de bioplásticos; en la depuración de aguas residuales, en fangos activados son de gran utilidad las bacterias aerobias y finalmente en la biodegradación de xenobióticos las Pseudomonas son empleadas en la biodegradación de hidrocarburos y algunos metales pesados.
Una de las principales ventajas de la biorremediación como lo explican Sánchez & Rodríguez (2010, pág. 12) se debe a que “esta tecnología utiliza el potencial metabólico de los microorganismos (fundamentalmente bacterias, pero también hongos y levaduras) para transformar contaminantes orgánicos en compuestos más simples y poco o nada contaminantes”, adicionalmente González (2011) explica que la biorremediación también se puede utilizar para limpiar terrenos o aguas contaminadas con el uso de recursos económicos más bajos que otras técnicas convencionales.
Como lo describe Safont (2012, pág. 7) otra de las ventajas de la biorremediación “es que es una tecnología poco intrusiva en el medio ambiente y generalmente no requiere componentes estructurales o mecánicos dignos de destacar”.
“Los costos de biorremediación se encuentran entre 100 y 250 USD/m3, mientras que las tecnologías convencionales, como la incineración o rellenos sanitarios seguros pueden costar entre 250 y 1000 USD/m3” (Volke, 2012). Debido a esto la biorremediación se convierte en una alternativa muy viable y eficaz, por cuanto algunos microorganismos son capaces de tolerar y degradar compuestos de gran toxicidad a bajo costo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento y bioestimulación de bacterias
Las muestras de agua residual fueron obtenidas de los diferentes efluentes de las industrias mineras, petroquímicas y metalúrgicas ubicadas en la región costa del Ecuador utilizando el método de muestreo aleatorio simple.
Para la bioestimulación se preparó medio de cultivo Agar Cetrimida DIFCOTM y se añadió 15 ml de estándar de plomo de 1000 ppm equivalente a 20 ppm de plomo; posteriormente se inoculó 0,1 y 1 ml de cada muestra en cajas petri previamente esterilizadas utilizando la técnica de siembra por inmersión y se incubaron por 48 horas a 25ºC en incubadora Memmert SNB-400. A continuación se revisó y contabilizó las unidades formadoras de colonias (UFC) y se separó las colonias que presentaron diferentes morfologías, el aislamiento bacteriano se realizó mediante siembra repetitiva de colonias obtenidas con la técnica de agotamiento por estrías en placa de agar Cetrimida hasta llegar a obtener cajas con morfología uniforme.
Caracterización bioquímica de bacterias
El inóculo se preparó con el kit de caracterización bioquímica The Microgen GN-ID A + B System y se procedió según el manual del usuario.
Selección de las cepas bacterianas resistentes a altas concentraciones de Plomo
Para la selección de las cepas bacterianas se preparó medio de cultivo basado en el procedimiento establecido por Ramírez & Coba (2012), como se detalla a continuación: 1 g de sulfato de sodio, 4 g de extracto de levadura, 5 g de sacarosa y 20 ppm de Pb aforados a 1 litro y se dispensó 300 ml en cada matraz. El mismo procedimiento se lo realizó para la concentración de 100 ppm de Pb. Posteriormente se inoculó cada cepa bacteriana en el medio de cultivo y se incubó a 22 °C durante 72 horas.
Análisis de la cinética de crecimiento bacteriano
Se consideró como factores ambientales: viabilidad de crecimiento, temperatura, pH y como factor independiente la concentración de plomo. El inóculo se preparó con las bacterias aisladas, presentes en las muestras obtenidas en los efluentes de agua residual; sin embargo, el experimento se realizó con aquellas bacterias que lograron adaptarse a concentraciones de 20 y 100 ppm de Pb.
Se preparó el medio de cultivo líquido establecido por Ramírez & Coba (2012), se añadió 15 ml de estándar de plomo de 1000 ppm que equivalen a 20 ppm de Pb, para la segunda concentración se añadió 0,184 g de acetato de plomo que equivalen a 100 ppm de Pb. A continuación, se dispensó 300 ml de medio líquido en cada uno de los matraces con las cepas seleccionadas anteriormente.
Elaboración de la curva de calibración
Para la elaboración de la curva de calibración se preparó los estándares McFarland del modo que se describe en la Tabla 1.
Una vez preparados los estándares McFarland se tomaron las lecturas por triplicado de cada uno de los estándares y el blanco (agua destilada) con el turbidímetro Lovibond Water Testing TB 210 IR. Con esos datos se pudo obtener la ecuación que define el crecimiento bacteriano.
Determinación de la curva de crecimiento
Para determinar la curva de crecimiento se inoculó las cepas bacterianas en los matraces, homogenizándolas con una agitación moderada, para luego ser incubados en dos bloques, incubación a temperatura ambiente e incubación a temperatura controlada (25 ˚C), la primera medición se realizó luego de 4 horas de iniciada la incubación. Para realizar la medición se tomó una alícuota del medio de cultivo previamente agitado, y se tomaron las lecturas con el turbidímetro ajustado a 860 nm.
Luego se midió consecutivamente la absorbancia de cada medio de cultivo inoculado en intervalos de 2 horas, hasta obtener lecturas constantes de absorbancia en los medios de cultivo.
Determinación de la curva de remoción
Para determinar la curva de remoción se preparó medio de cultivo a 20 ppm y a 100 ppm de Pb como se indica en el apartado 2.4; se sembró las cepas seleccionadas con anterioridad en matraces por duplicado, y se tomaron mediciones de pH, temperatura y turbidez, cada dos horas, durante 4 días.
Tratamiento estadístico de datos
En el análisis de los resultados se utilizó diferentes pruebas estadísticas, entre ellas, el coeficiente de correlación de Pearson, que permitió determinar el grado de relación existente entre la linealización de la curva de crecimiento y las variables: tiempo, temperatura interna del cultivo (TEMP), pH y concentraciones de plomo.
Para conocer si los datos siguieron una distribución normal (datos de pH y temperatura interna del cultivo) se utilizó la prueba de Normalidad de Shapiro Wilk; si el resultado de esta prueba era normal, se aplicó la prueba estadística t-Student (varianzas iguales), la misma que nos permitió determinar si existe o no una diferencia en promedio de los datos analizados; y si el resultado no era normal, se aplicó la prueba U de Mann Whitney para comprobar si el comportamiento de las dos variables era diferente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente estudio (fig. 1), se analizó un total de 152 microorganismos entre cepas y consorcios bacterianos; como se indica en la Tabla 2, seis cepas resultaron resistentes y/o tolerantes a las concentraciones de Pb ensayadas y seis cepas resultaron sensibles, es decir, que la proporción de bacterias aisladas resistentes es de un 50% y un 3.9% de bacterias resistentes con respecto al total de las colonias analizadas. Para realizar el experimento se seleccionaron cuatro cepas (2.63%) en función de su desempeño y de las características macro y microscópicas.
En la Tabla 3 se muestra la identificación de las bacterias tras los análisis de las pruebas bioquímicas, si el resultado en el porcentaje de certeza es 95% o superior quiere decir que existe una buena aproximación a la especie, caso contrario, existe una aproximación al género. Los resultados indicaron que únicamente Photobacterium damselae tuvo el 99.8% de certeza, es decir, existe gran aproximación a la especie, mientras que las otras tres cepas analizadas mostraron porcentajes inferiores al 95%, mostrando una buena aproximación al género.
Análisis de la cinética de crecimiento bacteriano
En la figura 2 se muestra las curvas de crecimiento bacteriano de las cuatro cepas experimentadas en incubación a temperatura controlada (25°C) e incubación a temperatura ambiente con una concentración de 20 ppm de Pb, en la figura 3 se muestra el crecimiento bacteriano a 100 ppm, bajo las mismas condiciones de temperatura de incubación. Al realizar un análisis comparativo entre las cuatro cepas, se determinó que Pseudomona sp presentó los valores más altos respecto a la capacidad de crecimiento a una concentración de 20 ppm a temperatura de incubación ambiente.
Figura 2 Crecimiento bacteriano a 20 ppm de Pb.A indica el crecimiento bacteriano a 20 ppm de Pb en incubación a temperatura controlada de 25°C, B indica el crecimiento bacteriano a 20 ppm de Pb en incubación a temperatura ambiente.
Figura 3 Crecimiento bacteriano a 100 ppm de Pb A indica el crecimiento bacteriano a 100 ppm de Pb en incubación a temperatura controlada de 25°C, B indica el crecimiento bacteriano a 100 ppm de Pb en incubación a temperatura ambiente.
Como se muestra en la Tabla 4, la cepa bacteriana Pseudomona sp obtuvo la mayor velocidad de crecimiento (K= 6,60E-2) en un menor tiempo de generación (g=1,52E+01) y el segundo número de generaciones (n = 4,68) más alto, después de Acinetobacter sp. Este resultado corrobora lo expresado por Jaehong y colaboradores (2015), quienes afirman que Pseudomona sp muestra una alta tolerancia y facilidad de crecimiento a 200 ppm de Pb.
Tabla 4 Cinética de crecimiento bacteriano a 20 y 100 ppmLos círculos en azul indican los valores máximos del número de generaciones (n), la mayor velocidad de crecimiento (k) y el tiempo de generación más bajo (g)
En la Figura 4 se muestra las curvas de remoción de Pb de las cepas experimentadas en incubación a temperatura controlada (25°C) e incubación a temperatura ambiente con una concentración de 20 ppm de Pb, del mismo modo en la Figura 5 se muestra la remoción de Pb a 100 ppm bajo las mismas condiciones de temperatura de incubación.
Figura 4 Remoción de Plomo a 20 ppmA indica la remoción de Pb a 20 ppm en incubación a temperatura controlada de 25°C, B indica la remoción de Pb a 20 ppm en incubación a temperatura ambiente.
Figura 5 Remoción de Plomo a 100 ppmA indica la remoción de Pb a 20 ppm en incubación a temperatura controlada de 25°C, B indica la remoción de Pb a 20 ppm en incubación a temperatura ambiente.
Tabla 5 Capacidad de remoción de Pb a 20 y 100 ppmEl círculo en amarillo muestra el mayor porcentaje de remoción de las cinco bacterias ensayadas.
Los resultados obtenidos al evaluar la capacidad bacteriana de remoción, mostrados en la Tabla 5, indicaron que Pseudomona sp presentó el porcentaje de remoción de Pb más alto (96.30%) a 100 ppm e incubación a temperatura ambiente. En su estudio Jaehong y colaboradores (2015), determinaron que las bacterias del género Pseudomona sp lograron remover hasta un 87% de Pb a una concentración de 100 ppm, y además mostró una tolerancia de hasta 400 ppm alcanzando un 61% de remoción. Con los resultados precedentes se pudo comprobar lo mencionado por Torres (2003), quien afirma que: el género Pseudomona es considerado como una de las bacterias más eficientes en la degradación de compuestos tóxicos y la remoción de metales pesados.
El valor más alto de remoción de Pb para el caso de Pseudomona sp se obtuvo en un rango de pH que varió de fuertemente ácido a ligeramente ácido (4,2-6,1), el mismo que fue registrado a 100 ppm en incubación a temperatura ambiente que varió de 18 a 23 ˚C; esto concuerda con los resultados obtenidos en su estudio por Tur y colaboradores (2013), quienes lograron determinar que el mayor porcentaje eficiencia de remoción de Pb fue del 97,4% a pH 5,2 a una temperatura ambiente de 32˚C.
CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos en esta investigación, se analizó un total de 152 colonias bacterianas, en la fase de aislamiento y bioestimulación; se seleccionaron 12 cepas morfológicamente diferentes, de las cuales seis cepas lograron adaptarse al medio de cultivo con Pb, presentando resistencia y/o tolerancia a las diferentes concentraciones experimentadas.
En los resultados de las pruebas bioquímicas del Kit Microgen GN-ID A+B para la identificación de bacterias resistentes al Pb, se pudo identificar los géneros: Acinetobacter, Pseudomona, Aeromona y la especie Photobacterium damselae, que obtuvo el 99,8% de certeza, es decir, que presenta una gran aproximación a la especie, mientras que las otras tres cepas analizadas muestran una buena aproximación al género.
En el análisis de la cinética de crecimiento bacteriano se determinó que Pseudomona sp presentó una mayor facilidad de crecimiento a una concentración de 20 ppm, a temperatura de incubación ambiente, debido a su mayor velocidad de crecimiento en un tiempo de generación menor.
En el análisis de la curva de remoción de Pb, Pseudomona sp registró un porcentaje de remoción del 96,30% a una concentración de 100 ppm e incubación a temperatura ambiente, siendo este valor el más alto de las cuatro cepas experimentadas, es por esta razón que este género ha sido considerado como uno de los más eficientes en la degradación de compuestos tóxicos y metales pesados.
