2.1. Descripción del sitio

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Química Agrícola y Suelos [LQAS] de la Facultad de Ciencias Agrícolas [FCAg], Universidad Central del Ecuador [UCE]. Las muestras se obtuvieron de un estudio a largo plazo, ubicado en el Lote 4.2 del Campo Académico Docente Experimental “La Tola” [CADET], de la UCE. El sitio está ubicado en el sector “La Morita” de la parroquia Tumbaco, cantón Quito, perteneciente a la provincia de Pichincha, el cual se encuentra a una altitud de 2.465 m s.n.m., a 78°21'18" de longitud oeste y 00°13'49" de latitud sur. La precipitación media anual reportada es de 868 mm, temperatura de 17 °C y humedad relativa de 73,9 %. El suelo del sitio fue clasificado como Entic Durustolls (^{Moreno et al., 2017}).

2.2. Muestreo de suelo

Al finalizar el ciclo de cada cultivo: fréjol (octubre, 2016) y maíz (marzo, 2018), se tomó una muestra compuesta de suelo de aproximadamente 1 kg de cada tratamiento, misma que se obtuvo a partir de cinco submuestras aleatorias en cada una de las subparcelas, a una profundidad de 0-20 cm. Posteriormente, se homogenizó y se colocó en fundas herméticamente cerradas y debidamente etiquetadas para ser transportadas en un enfriador con hielo, hasta los laboratorios. Las muestras se conservaron en congelación a una temperatura de -20 ℃ hasta la realización de los análisis correspondientes.

2.3. Determinaciones biológicas del suelo

En el LQAS, de la FCAg-UCCE, se procedió a realizar el análisis de las muestras en estudio con las metodologías descritas para las variables físicas, químicas y biológicas seleccionadas para la presente investigación.

La BM se determinó en laboratorio con el método fumigación-incubación. Los datos obtenidos se expresaron en mg C-CO₂ g^-1suelo seco (^{Bottomley et al., 2018}). La RM, se determinó en mg C-CO₂ g^-1suelo. Para el efecto, las muestras se introdujeron en frascos de vidrio con tapa hermética, se ajustó la humedad y posteriormente se incubaron las muestras por 4 días a 27 °C. El CO₂ generado se recogió en una solución de NaOH (^{Ristow et al., 2017}). Para determinar la fosfatasa ácida, se utilizó p-nitrofenilfosfato como sustrato de la reacción, el cual se determinó utilizando espectrofotómetro a 400 nm de longitud de onda. La actividad de la enzima se expresó como µg de p-nitrofenilfosfato g ^-1 h^-1(^{Paolini Gómez, 2016}). Para el caso de la β–G, el suelo reaccionó con p-nitrofenil-ß-glucopiranósido, y se midió el contenido del p-nitrofenol liberado en el espectrofotómetro a 420 nm de longitud de onda. La actividad de la enzima se expresó en µg p-NF g^-1 h^-1 (^{Paolini Gómez, 2010a}). Finalmente, para el caso de la determinación de la FDA, se utilizó el método basado en el clivaje hidrolítico del FDA a fluoresceína por lipasas; después se incubó 2 g de suelo a 30 °C por 30 minutos a baño María con una solución de 1.000 µg ml^-1de FDA, se midió el filtrado en espectrofotómetro a 490 nm de longitud de onda. Los resultados de la actividad de la enzima se expresaron como µg de fluoresceína g^-1 de suelo seco h^-1 (^{Paolini Gómez, 2010b}).

2.4. Análisis estadístico

Los factores en estudio son los sistemas de labranza [SL] (SD: siembra directa LC: labranza convencional), niveles de fertilización nitrogenada [NN] (N0: 0 %, N1: 50 %, N2: 100 % y N3: 150 %) y cultivos [CC] (C1: fréjol, C2: maíz). Con respecto a los niveles, estos se establecieron con base en la recomendación de fertilización del cultivo (fréjol y maíz) (Tabla 1), efectuada por el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias [INIAP]. N2 corresponde al nivel de 100 % y representa la fertilización normal.

Tabla 1 Dosis y fuente de fertilización en el cultivo de fréjol y maíz.Table 1. Dose and source of beans and corn crops fertilization. 

Los datos obtenidos se analizaron bajo un diseño Crossover para el factor niveles de N con anidamiento en los factores sistema de labranza y cultivo.

Se comprobó la normalidad de las variables (prueba de Shapiro-Wilk) y se realizó el análisis de varianza (ADEVA). Para la separación de medias de los tratamientos, se utilizó la prueba DMS al 5 %. Además, se realizó el análisis de correlación de Pearson de las variables en estudio. Adicionalmente, se desarrolló el análisis de componentes principales [ACP] con la finalidad de describir la correlación de las variables en estudio de los factores cualitativos, como el SL y el cultivo; identificando cuáles describen mejor el manejo sostenible de la calidad del suelo. Para el análisis estadístico se utilizó el programa R, versión 3.6.1 (^{R Core Team, 2019}).

3.1. Biomasa microbiana

El tratamiento LCN2C1 registró el mayor promedio de BM con 1,85 mg C-CO₂ g^-1suelo seco, mientras que LCN1C2 mostró el promedio más bajo con 1,13 mg C-CO₂ g^-1suelo seco (Figura 1). Estos resultados permiten inferir que la BM se incrementa bajo LC y el nivel óptimo de fertilización nitrogenada en el cultivo fréjol, mientras que cuando se utilizan niveles más altos o bajos de N recomendado en el cultivo de maíz, existe menor BM. ^{Zagal y Córdova (2005)}, al evaluar sistemas de rotación maíz-trigo-praderas con fertilización nitrogenada en un Andisol en Chile, Centro Regional de Investigación Quilamapu {INIA)], no encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos evaluados en cuanto al C de la BM. Por su parte, ^{Ferreras et al. (2009)}, en un estudio sobre un Argiudol típico de Argentina reportaron que la BM fue sensible al manejo; los valores obtenidos fueron 130, 149, 164, 216 y 243 µg C-CO₂ g^-1 para los tratamientos con SD bajo fertilización utilizada por los agricultores, SD bajo fertilización doble, SD cultivo de cobertera antes del cultivo y un suelo con LC, respectivamente.

Figura 1 Variación en la biomasa microbiana, por efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 1. Variation in microbial biomass, due to the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

3.2. Respiración microbiana

El efecto principal de los niveles de N (Figura 2) sobre la RM fue observado con el promedio más alto asociado con N0 (0,33 mg C-CO₂ g^-1 suelo seco) y el más bajo con N1 (0,24 mg C-CO₂ g^-1 suelo seco). Con estos resultados se puede inferir que cuando se emplea fertilización nitrogenada, la RM se reduce posiblemente porque el aporte de N promueve la mineralización de la MOS y reduce las fuentes carbonadas presentes en el suelo para su aprovechamiento por parte de los microorganismos. Estos resultados contradicen a lo expuesto por ^{Terumi Sanomiya et al. (2006),} quienes al evaluar la RM en un alfisol (Brasil) al que se aplicó 60 kg N ha^-1 frente a un testigo y sin fertilizante nitrogenado, no encontraron diferencias significativas entre los tratamientos estudiados. Sin embargo, las diferencias numéricas entre el suelo fertilizado y sin fertilizar fueron de 64 y 68 mg C-CO2 g^-1 suelo seco, respectivamente.

^{Toledo et al. (2013)} por su parte, al estudiar en el departamento de Oberá, provincia de Misiones, un Oxisol bajo selva (presencia de gran variedad de árboles de gran porte, abundancia de lianas y plantas epifitas y sin perturbación antrópica, cultivo de maíz bajo monocultivo por 7 años, sin fertilización ni residuos orgánicos y LC; y cultivo de té con fertilización nitrogenada cada año, mecanización para la cosecha y sin aplicación de enmiendas orgánicas; determinaron que la RM in situ fue mayor en el cultivo de maíz, después en selva y finalmente en cultivo de té con valores de 65 y 26 kg C-CO₂ ha^-1 día^-1; respectivamente. El cultivo de té con fertilización nitrogenada obtuvo el menor promedio de RM.

Figura 2 Variación en la respiración microbiana por efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 2. Variation in microbial respiration due to the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

3.3. Fosfatasa ácida

La actividad de la enzima fosfatasa ácida (Figura 3) respondió al manejo bajo SL, NN y cultivo. Con estos resultados se puede argumentar que bajo LC se incrementa la actividad de la enzima fosfatasa ácida cuando se emplea la fertilización nitrogenada en el cultivo de maíz. Por el contrario, al emplear fertilización nitrogenada en maíz bajo SD, la actividad de la fosfatasa ácida se reduce. Estos resultados son similares a los reportados por ^{García y Rivero (2012)}, quienes encontraron diferencias significativas al evaluar el efecto de residuos de maíz en un Inceptisol proveniente del estado Portuguesa, en Venezuela, que estuvo bajo LC y SD sobre la fosfatasa ácida con valores de 592 y 641 µg p-NF g suelo^-1 h^-1, respectivamente.

Figura 3 Variación en la actividad de la enzima fosfatasa, por efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 3. Variation in the activity of the phosphatase enzyme due to the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

Las condiciones creadas por la SD y acumulación de residuos de maíz generan mayor cantidad de sustrato para los microorganismos debido a la acumulación de MO a largo plazo. De igual forma, ^{Heidari et al. (2016)}, en Irán, al estudiar el efecto de SD y LC, ambas con fertilización mineral en un Entisol bajo rotación (soya-maíz) obtuvieron promedios de 146 y 126 µg PNP g^-1 h^-1; respectivamente. Además, ^{Toresani et al. (2009)}, al evaluar labranza combinada (labranza mínima para trigo, labranza vertical en maíz y soja), obtuvieron 429 µg p-NF g^-1 h^-1, en SD con fertilización doble 502 µg p-NF g^-1 h^-1 y en SD con fertilización del agricultor 512 µg p-NF g^-1 h^-1 sobre distintos suelos en rotación (trigo/maíz/soja/soja). La SD con y sin fertilización presentó mayor actividad de fosfatasa ácida en comparación con labranza mínima.

Los residuos dejados en superficie son importantes para promover la actividad de la enzima cuando se combina con SD debido a que se reduce la evaporación del suelo, manteniendo su humedad y temperatura, lo que permite la rápida descomposición de los residuos por macro, meso y microorganismos (^{Ferreras et al., 2009}; ^{Utobo y Tewari, 2015}).

3.4. Fluoresceína diacetato (FDA)

Se evidenció el efecto de la interacción NN*CC sobre la actividad de la enzima FDA (Figura 4). En el rango más alto se ubica N2C1 con una media de 164,7 µg de fluoresceína g^-1 h^-1 y en el rango más bajo se ubica N0C1 con 74,7 µg de fluoresceína g^-1 h^-1. Se puede inferir con estos resultados que la fertilización nitrogenada afectó la actividad de la FDA en el suelo bajo el cultivo de fréjol, sin embargo, cuando no se aplica N al suelo la actividad de la enzima se reduce drásticamente. La FDA es mayor en los suelos fertilizados ya que la aplicación de nutrientes favorece el crecimiento del cultivo que junto con la excreción de exudados del sistema radicular promueven la actividad de los microorganismos. Además, los residuos vegetales constituyen una fuente carbonada para la acción microbiana (^{Serri et al., 2018}).

Figura 4 Variación en la actividad de la enzima FDA por efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 4. Variation in the activity of the FDA enzyme due to the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

En la localidad de Teodelina, provincia de Santa Fe, ^{Conforto et al. (2010)}, al evaluar la actividad de la FDA en el cultivo de maíz bajo diferentes dosis y mezclas de fertilizantes químicos (diferentes dosis de N, P, S y micronutrientes), encontraron que el promedio de los tratamientos de NP, NPS y PS fueron estadísticamente superiores (2,0 µg fluoresceína g ^-1 h^-1) al testigo sin fertilización y a la fertilización solo con N y S (1,71 µg fluoresceína g ^-1 h^-1).

3.5. β-Glucosidasa

La actividad de la enzima β-G (Figura 5), presentó significancia estadística para la interacción de SL*NN*CC. Con estos resultados se puede inferir que la actividad de la enzima se ve favorecida bajo el cultivo de fréjol, siempre y cuando se utilice fertilización nitrogenada con LC. Por el contrario, bajo el cultivo de maíz y fréjol con SD y al utilizar fertilización nitrogenada, la actividad de la β-G se redujo. La dinámica de la actividad de la enzima β-G es al momento un indicador de la calidad del suelo muy estudiado por su rol en el ciclo del C, particularmente por su participación en la degradación de la celulosa a su forma más simple, la glucosa (^{Lillo et al., 2011}). En la literatura se reportan diversos valores de la actividad de β-G desde 31,9 a 208,1 µg p-NF g^-1 h^-1(^{Henríquez et al., 2014}) y 69,5 a 850,7 µg p-NF g^-1 h^-1 (^{Paz-Ferreiro et al., 2007}), valores que están dentro del promedio de los encontrados en el presente estudio.

Figura 5 Variación en la actividad de la enzima β-glucosidasa por efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 5. Variation in the activity of the β-glucosidase enzyme due to the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

Diferentes sistemas de manejo del recurso suelo se han propuesto para evaluar la actividad de la enzima β-G. Así, ^{Acosta-Martínez (2019)}, al evaluar la actividad de la β-G en un suelo de Minnesota bajo rotación (alfalfa–maíz–soya–trigo) y la típica práctica de siembra maíz–soya, encontró que la actividad de la enzima β-G bajo rotación fue mayor con 163 mg PNP kg⁻¹ en comparación con la rotación maíz–soya con 120 mg PNP kg⁻¹.

^{Serri et al. (2018)}, al evaluar LC, labranza mínima y labranza mínima con aporte orgánico en uva (Vitis vinifera L.), determinó que el p-NF logrado con el manejo orgánico (sin aplicación de fertilizantes ni pesticidas) fue estadísticamente significativo con un promedio de 120 µmol p-NF g^-1 h^-1 en comparación con la LC y la labranza mínima que presentaron valores de 72 y 66 µmol p-NF g^-1 h^-1, respectivamente. Se considera que la aplicación de residuos orgánicos propios del cultivo es una fuente de C para el suelo y energía para los microorganismos.

^{Nevins et al. (2020)} reportaron un incremento en la actividad enzimática cuando emplearon labranza mínima con la incorporación residuos de cultivo de cobertera. La actividad de la enzima β-G se incrementó porque al emplear la labranza, el tamaño de los residuos disminuye y los incorpora en el suelo para que sean degradados rápidamente por los microorganismos. Además, los residuos de leguminosas incorporados al suelo se descomponen más rápido por su baja relación C:N, al contrario de lo que sucede con los residuos de maíz que al poseer una relación C:N alta y lignina en su composición química, requieren más tiempo para degradarse.

^{Ochoa et al. (2007)} en su trabajo, reportaron que bajo SD se obtuvo mayor actividad de la β-G, en comparación con LC. Igual comportamiento se documentó en los ensayos realizados por ^{Bandick y Dick (1999)}, quienes compararon tratamientos con N inorgánico (0 y 90 kg ha^-1), abono verde y estiércol. Al igual que en las investigaciones anteriores, el uso de enmiendas orgánicas y aplicaciones de N estimularon la actividad de la enzima β-G en contraste con el tratamiento sin aplicación de N. La enzima β-G es utilizada como indicador por ser sensible a los cambios en el manejo del suelo.

El análisis de correlación de Pearson p < 0,05 (Tabla 3) mostró que la BM presenta correlación positiva con la actividad de la enzima fosfatasa (0,50). ^{Lillo et al. (2011)} encontraron correlación positiva entre estas variables (0,66); explicándose que la mayor actividad de los microorganismos se debe a la cantidad de C disponible en el sustrato. En el sistema LC, incorporando N y bajo el cultivo de fréjol, existe mayor sustrato lábil para que los microorganismos mineralicen nutrientes con facilidad. La actividad de la enzima fosfatasa ácida presentó correlación positiva moderada con BM (r = 0,50). ^{Farrus Miró (2016)} determinó correlación entre la BM y fosfatasa (0,65) al evaluar diferentes abonos orgánicos y fertilización mineral en lechuga. Cabe indicar que la actividad de las enzimas depende de factores como: cantidad de BM presente en el suelo, pH, temperatura, humedad del suelo y cantidad y calidad de residuos orgánicos disponibles (^{Gabbarini et al., 2017}).

Tabla 3 Matriz de correlación de Pearson para las variables biológicas, en el efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Table 3. Pearson's correlation matrix for biological variables, on the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of Andean soil in Ecuador. 

Adicionalmente, la FDA se correlacionó significativamente con la β-G (0,60). ^{Alvear et al. (2007)}, al evaluar las propiedades bioquímicas como efecto de los residuos provenientes de dos plantaciones de Pinusradiata, determinaron correlación positiva entre FDA con β-G (0,63); además indicaron que la actividad de las enzimas depende de las condiciones climáticas y calidad de residuos, que contribuyen a la descomposición de la MOS. El N, producto de la fertilización nitrogenada sumado al N incorporado por Rhizobiumsp, y la baja relación C:N de los residuos del cultivo de fréjol incrementan la descomposición de los residuos, que a su vez benefician a la dinámica de los nutrientes y energía para una mayor actividad enzimática en el suelo (^{Serri et al., 2017}).

Asimismo, ^{Alvear et al. (2005)} encontraron correlación entre las enzimas β-G y FDA (0,88), indicando que las leguminosas proveen sustratos carbonados que son empleados para la nutrición y energía en los suelos. Los residuos son fácilmente degradables por los microorganismos; además, se incrementa su actividad, lo que conlleva a una mayor secreción de enzimas que participan en el ciclado de los nutrientes.

La influencia del manejo en cada variable evaluada se presenta en la Figura 6. La actividad de la enzima fosfatasa fue mejor en LCN3C2; la enzima FDA fue mayor en el C1 independientemente del SL empleado; sin embargo, fue mayor con la fertilización nitrogenada. Por su parte, la actividad de β-G fue mayor en LCC1 en los tratamientos donde se aplicó fertilización nitrogenada. La BM respondió al manejo bajo LC con el C1 al emplear el nivel óptimo de fertilización nitrogenada, contrastando con lo encontrado por ^{Alhameid et al. (2019)}, quienes reportaron que el C de la BM es mayor bajo SD frente a LC, debido a que los residuos provenientes del cultivo anterior promueven la acumulación de MO en la capa superficial del suelo, por ende, mejora la retención de HS, lo que favorece la actividad de los microorganismos.

Figura 6 Análisis de componentes principales para estimar el agrupamiento de los indicadores de calidad del suelo por sistema de labranza y cultivo, en el efecto de la labranza, fertilización nitrogenada en los cultivos de fréjol y maíz sobre indicadores biológicos de la calidad de un suelo andino del Ecuador.Figure 6. Principal component analysis to estimate the grouping of soil quality indicators by tillage system and crop, on the effect of tillage, nitrogen fertilization in bean and corn crops on biological indicators of the quality of an Andean soil in Ecuador. 

La RM no presentó efecto del SL ni del CC, sin embargo, la RM fue mayor cuando no se empleó fertilización nitrogenada. La aplicación elevada de fertilizantes nitrogenados reduce la actividad de la RM, y también la reducción de las fuentes carbonadas contribuye al descenso de la RM (^{López, 2017}).

Los SL, NN y CC influenciaron sobre la actividad de la fosfatasa ácida. La LC en el C2 con el nivel alto de N incrementa la actividad de fosfatasa en el suelo, pero el fenómeno contrario ocurre con la aplicación del tratamiento SDN2C2. Este comportamiento podría explicarse como el efecto de la LC que al voltear el suelo hace que los residuos entren en contacto con los microorganismos, los cuales lo degradan fácilmente. Sin embargo, diversas investigaciones (^{Gabbarini et al., 2017}; ^{Gálviz et al., 2007}; ^{García y Rivero, 2012}; ^{Heidari et al., 2016}) determinaron el efecto contrario, es decir, bajo SD la actividad de la enzima es mayor en comparación con LC debido a que los residuos vegetales en superficie incrementan la actividad de la fosfatasa ácida.

Los SL no influyeron sobre la actividad de la FDA, sin embargo, en el C1 al emplear fertilización nitrogenada (N1, N2 y N3) existió mayor actividad en comparación al suelo sin aplicación de N.

La aplicación de los tratamientos de SL, NN y CC afectaron el contenido de β-G. El C1 bajo LC y el empleo de dosis óptima de N presentó mayor actividad de la β-G en comparación con la SDN1C2. ^{Alhameid et al. (2019)}, en un experimento en un suelo sujeto a LC y SD durante 25 años, y con rotaciones de dos años bajo el cultivo de maíz y soya, determinaron que no hubo significancia estadística entre los tratamientos de labranza. Sin embargo, los mayores promedios de β-G se obtuvieron bajo el cultivo soya (952,5 µmol PNG kg^-1 suelo h^-1) en comparación con el cultivo de maíz (801 µmol PNG kg^-1 suelo h^-1), concluyendo que la calidad de los residuos, además de los factores abióticos como temperatura y HS, estimulan la actividad de las enzimas.

Los resultados de la presente investigación indican que CP1 y CP2 tienen la mayor porción de la varianza (60,3 %), los indicadores que conforman estos dos componentes (BM, RM, Fosfatasa ácida, FDA y β-G) son de fácil medición, sensibles al manejo; por lo tanto, pueden ser usados como indicadores de calidad del suelo bajo las condiciones edafoclimáticas evaluadas. De todos los indicadores biológicos planteados como aptos para medir la calidad de un suelo bajo SL, NN y CC; las variables biológicas evaluadas contribuyeron a explicar la variabilidad de los datos.