1 Introducción

Las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) se pueden detectar a nivel basal en los tejidos sanos de las plantas, pero aumentan su presencia ante el ataque de patógenos. La activación de las PR puede comenzar solo después de una fase de interacción de la planta-patógeno, a partir del reconocimiento de patrones moleculares asociados con microorganismos (PAMPs) por receptores de reconocimiento de estos patrones (PRR) presentes en la membrana celular de las plantas, o mediante el reconocimiento de elicitores como proteínas con dominios de unión a nucleótidos y repeticiones ricas en leucina (NB-LRR). La concentración de PRs aumenta con la transducción de señales químicas como el ácido salicílico, el etileno y el ácido jasmónico durante la primera etapa de activación de los mecanismos de defensa (, ; , ). Los péptidos antimicrobianos (AMPs) son una parte de las PRs, tienen un peso molecular menor a 10 kDa y una actividad antimicrobiana in vitro. Los AMPs se producen por microorganismos, animales y plantas como mecanismo de defensa contra los patógenos (, ).

Los AMPs tienen menos de 200 aminoácidos, se expresan constitutivamente y se inducen en tejidos susceptibles como primordios foliares, estomas y epidermis. Por ejemplo, en Nicotiana megalosiphon se evidenció que tras la inoculación con Peronospora hyoscyami sp. tabacina expresó en hojas un gen de defensina, y en Brassica oleracea inoculada con Xanthomonas campestris pv. campestris se expresaron genes de AMPs en tallo y hojas; también se observó que el pimiento inoculado con X. campestris pv. vesicatoria provocó una alta transcripción en el gen CaAMP1, y su expresión generó tolerancia a Phytophthora sojae (, ; , ; , ; , ). Se ha evidenciado que los AMPs catiónicos como las tioninas alfa/beta, defensinas y los péptidos de transferencia de lípidos (LTPs) interactúan con grupos aniónicos de la bicapa fosfolipídica en los microorganismos. También se forman micelas que permiten el flujo de iones hacia el espacio extracelular con descompensación osmótica, lisis celular y muerte ( , ).

Los AMPs aniónicos, como los ciclotidos, interactúan con la membrana citoplasmática de los patógenos a través de fuerzas electrostáticas entre los residuos polares de un AMP y las cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos, mediante el reconocimiento de la columna vertebral quiral del glicerol. La fuerza electrostática de esta unión compleja está determinada por una interacción iónica entre el grupo amonio de la fosfatidiletanolamina y el grupo carboxilo de un glutamato conservado del bucle 1 del AMP (, ; , ). La permeabilización sufrida por la membrana citoplasmática en la interacción microorganismo/AMP no es del todo clara. Se han descrito cuatro posibles mecanismos: (i) hélices peptídicas que forman un haz en la membrana con un lumen central, (ii) los AMPs se acumulan en la superficie de la bicapa lipídica interactuando con las cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos, cubriendo la membrana como una alfombra y causando la desorganización de la bicapa lipídica, (iii) los AMPs se insertan en la membrana, formando un poro e induciendo una flexión continua de la monocapa lipídica, lo que provoca que la superficie hidrófoba de la membrana se oriente hacia el exterior y la superficie hidrofílica hacia el interior, formando un canal acuoso con pérdida de polaridad, (iv) el AMP provoca un desplazamiento competitivo de Ca2+ y Mg2+ (, ; , ).

La manzanilla romana Chamaemelum nobile (L.) es una hierba perenne aromática, con un tallo ramificado y alargado que alcanza una altura de entre 20 y 30 cm, que sostiene una cabeza floral formada por hojas blancas con lígulas segmentadas y folíolos bien definidos. Crece en zonas templadas, es adaptable y se utiliza en varios tipos de suelos ácidos con suficiente agua. C. nobile. Contiene entre un 0,24 % y 1,9 % de aceites volátiles y alrededor de 120 metabolitos secundarios, incluidos flavonoides (quercetina, luteolina, apigenina, patuletina), alfa-bisabolol y óxidos de bisabolol A y B, azulenos (camazuleno), monoterpenos (alfa-pineno), sesquiterpenos (farneseno), cumarinas (herniarina y umbeliferona). Su composición le otorga posibles propiedades terapéuticas reconocidas (antiinflamatorias, espasmolíticas, sedantes, antioxidantes, anticoagulantes, antihiperlipidémicas, repelentes y antimicrobianas).

La producción mundial de C. nobile supera las 1000 toneladas/año. Se utilizan 800 kg de tallo floral/ha para producir entre 0,8 % y 1,5 % de aceites esenciales. De igual forma, se pueden obtener compuestos fenólicos y alcanos de las semillas, frutos o raíces. Los aceites de C. nobile son efectivos in vitro contra Staphylococcus aureus (0,1 mg/mL), Escherichia coli (0,1 mg/mL), Bacillus subtilis (0,05 mg/mL), Pseudomonas aeruginosa (12,5 y 25 mg/mL), P. tolaasii (300 mg/mL), Candida albicans (0,1 mg/mL), y hongos como Aspergillus candidus, Penicillium sp., Fusarium culmorum y A. niger (900 mg/mL) ( , ; , ; , ; , ).

El objetivo de esta investigación fue encontrar un AMP catiónico de C. nobile (denominado cnLTP) enfocado en identificar la secuencia de ADN de un LTP. Los parámetros a utilizar fueron las pruebas bioinformáticas y moleculares, y la evaluación sobre Rhizoctonia solani, que es un patógeno de la papa.

2 Materiales y Métodos

3 Resultados

Las semillas de manzanilla romana se cultivaron en un medio MS suplementado con hormonas de crecimiento con el objetivo de inducir la germinación y el crecimiento de plántulas adecuadas para la extracción de ADN genómico. La PCR identificó un producto de aproximadamente 300 pb, que pudo ser determinado mediante secuenciación. Esta secuencia se comparó con las entradas de nucleótidos registradas en la base de datos GenBank utilizando el programa BLAST (, ). La secuencia de ADN (297 pb) mostró una estrecha relación con los LTPs de tomate (identidad 96 %, valor E 4e57, cobertura 96 %, NCBI). Este conocimiento, a su vez, permitió deducir la secuencia del cnLTP (99 residuos) que codifica el ADN y que contiene únicamente secuencias de ADN codificante para el péptido maduro, sin señal peptídica ni sitio de poliadenilación. La secuencia de aminoácidos en el cnLTP y, por lo tanto, la función de la proteína, está determinada por ocho residuos de C que están enlazados en cuatro puentes disulfuro (Figura 1A).

Figura 1 Estructura de cnLTP. A. Alineación de dos LTPs de tomate con cnLTP, asociada con propiedades fisicoquímicas según Clustal Omega (, ): en rojo, aminoácidos pequeños e hidrofóbicos (junto con aromáticos -Y); en azul, ácidos; en magenta, básicos - H; en verde, hidroxilo, sulfhidrilo, amina y G; en gris, aminoácidos e iminoácidos inusuales. B. Modelo 3D de cnLTP, la flecha negra indica el terminal N, la flecha blanca señala el terminal C. Las hélices están indicadas y coloreadas en negro. 

El peso molecular teórico del cnLTP es de 9,8 kDa y su punto isoeléctrico es de 9,39. Además, el péptido está compuesto por 33 residuos alifáticos (A, V, I y L), el índice alifático del cnLTP es 85, el cual determina el volumen ocupado por cadenas laterales alifáticas, y contiene 12 residuos cargados positivamente debido a la conformación catiónica del cnLTP a pH neutro, y tres residuos cargados negativamente. La hidropatía es 0,127, lo que indica la presencia de una cavidad hidrofóbica donde también ocurre la interacción con lípidos. El cnLTP está formado por cuatro alfa-hélices. La primera hélice (P2-Q24) presenta una estructura H1A (P2-S5) formada por dos pliegues en His3 y Gly4, y H1B (P18L23) formada por cuatro pliegues en Q11, G15, C19 y Y22. La segunda hélice H2 (C32-L39) contiene tres pliegues en R34, G35 y L39. La tercera hélice H3 (P46-A62) comprende siete pliegues en D48, K50, A52, T54, L56, K57, A59 y N61. La cuarta hélice H4 (L68-C78) encierra pliegues en G69, I74 y S76. Las cuatro alfa-hélices están conectadas por tres bucles cortos, L1 (G25-G31), L2 (L40-T45) y L3 (I63-N67) (Figura 1B). El cnLTP está estabilizado por cuatro puentes disulfuro formados entre C9-C33, C19-C55, C32-C78 y C53-C92, los cuales se calcularon mediante DISULFIND (http://disulfind.dsi.unifi.it/) (, ). El cnLTP contiene 50 residuos hidrofóbicos: A, V, L, I, P, F y C, estando la mayoría en el interior del péptido, formando una cavidad hidrofóbica, lo que es característico de esta familia de AMPs (, ).

La evaluación biológica del fluido apoplástico de C. nobile se llevó a cabo teniendo en cuenta la concentración de proteínas (2,37 mg/mL), así como la presencia intrínseca de péptidos de bajo peso molecular, de aproximadamente 10 kDa, lo que indicaría que son LTPs (Figura 2A). Las pruebas de antagonismo indicaron un efecto inhibitorio sobre R. solani a una concentración de 1 µg/mL (Figuras 2B2C).

Figura 2 Bioensayo del AWF de C. nobile en R. solani. A. Tricina SDS-PAGE mostró una banda de 10 kDa relacionada con LTPs en el AWF de C. nobile (líneas 1 y 2, M es el marcador de peso molecular). B. Control positivo que contiene carriles con suspensión de la cepa P. aeruginosa PAO1 (flechas negras). C. Micelio de R. solani con carriles de AWF de C. nobile a cada lado, que se fueron extendiendo gradualmente en el medio; los cuadros muestran las áreas de inhibición. 

4 Discusión

Los péptidos permiten que las bacterias evadan la defensa del huésped y se proliferen al impedir la señalización celular, la migración celular e incluso pueden matar directamente las células de respuesta. Los péptidos tienen mecanismos de daño complejos sobre las membranas celulares (ruptura), la síntesis de proteínas (inhibición), los segundos mensajeros (activación) o la respuesta de defensa (activación) (, ). Hasta ahora, se ha sugerido que una caracterización bioquímica específica enfocada en la actividad biológica específica o un diseño asistido por computadora son vías para el descubrimiento de nuevas opciones biotecnológicas (, ).

En los LTPs, una secuencia señal es la responsable de dirigir el péptido hacia la membrana citoplasmática, donde es llevada en el extremo N por una aminopeptidasa, y el péptido maduro se exporta al espacio intercelular, donde ejerce su actividad biológica (, ). El cnLTP maduro tiene una sustitución conservada (T-S), además de dos sustituciones semiconservadas (E-S, N-S). Se ha informado que la conservación del sitio de fosforilación de S (que podría ser intercambiado por T o E fosforilables) sería uno de los residuos clave para el plegamiento de la proteína (, ). La presencia de la cavidad hidrofóbica es esencial en la familia de los LTPs, ya que permite la unión y transferencia de lípidos, por ejemplo, un LTP de trigo que tenía una cavidad hidrofóbica capaz de atraer prostaglandina B2 y movilizarla entre fracciones microsomales y mitocondrias. La cavidad hidrofóbica de los LTP puede unirse a ácidos grasos saturados (12-19 átomos de carbono), ácidos grasos insaturados de diferentes longitudes de cadena (16-18 átomos de carbono) y geometría de insaturación, lisolípidos (14-16 átomos de carbono) y ácido jasmónico (, ; , ).

Los LTPs se dividen en dos grupos según su peso molecular y conformación estructural: (i) tipo 1 (9-10 kDa), que están formados por cuatro alfahélices y se caracterizan por tener actividad inhibitoria sobre fitopatógenos; (ii) tipo 2 (7,0 kDa), que también están formados por cuatro alfa-hélices, pero no muestran actividad inhibitoria sobre los patógenos de las plantas (, ). El cnLTP pertenece al tipo 1 de los LTPs, en particular por su peso molecular (9.8 kDa) y sus cuatro alfa-hélices. Los LTPs tienen actividad biológica contra bacterias y hongos como Clavibacter michiganensis, P. solanacearum, P. syringae, Alternaria brassicola, Ascochyta pisi, Colletotrichum lindemuthianum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum, F. oxysporum, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae ( , ). Las pruebas de antagonismo indicaron un efecto inhibitorio del AWF de C. nobile sobre R. solani, por ejemplo, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de los aceites de C. nobile sobre Penicillium sp. y Aspergillus sp. (, ). La localización de un LTP en la pared celular y su externalización hacia el espacio intercelular por una secuencia señal sugiere su presencia en el fluido apoplástico, como se ha evidenciado en Arabidopsis thaliana, B. oleracea, Ricinus communis y Vigna unguiculata (, ). Se aislaron dos LTPs (IWFI e IWFI2) del fluido de lavado intercelular de Beta vulgaris con actividad antifúngica sobre Cercospora beticola, demostrando su presencia en el AWF (, ). I-TASSER puede indicarnos cómo el cnLTP interactúa con componentes celulares; por ejemplo, el cnLTP puede unirse químicamente al ácido palmítico, ya que este constituye el 30 % de todos los fosfolípidos (, ).

5 Conclusiones

Este proyecto exploró el problema de la identificación y caracterización de nuevos AMPs de C. nobile. Se encontraron características relevantes del cnLTP (por ejemplo, la cavidad hidrofóbica o los puentes disulfuro); de igual forma, se analizó su actividad sobre R. solani. Finalmente, las plantas medicinales como C. nobile pueden ser una fuente interesante de AMPs para ser utilizados en Biotecnología, ya que poseen claves para la síntesis mejorada de nuevas moléculas o moléculas optimizadas, creando condiciones para su adaptación.