2.1. Análisis bromatológico

Los procedimientos usados para la determinación de la composición de la cáscara de banano fueron los establecidos en los métodos oficiales normalizados de la AOAC (^{AOAC, 2000}). Así, se aplicaron métodos gravimétricos para determinar humedad y sólidos totales (925.10), determinación por vía seca de ceniza (923.03), extracción por solvente para grasa (991.36), método Kjeldahl para proteína (981.10) y NTE INEN 542:1980 para Fibra. Los carbohidratos se determinaron por cálculo.

2.2. Extracción

Se realizaron dos tipos de extracción. El primer método consistió en una ‘maceración sucesiva’ con cuatro solventes de polaridad creciente: éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo y agua. El segundo método consistió en la obtención de un extracto etanólico crudo por maceración (‘maceración etanólica’) que posteriormente fue sometido a un proceso de fraccionamiento. Previo al proceso de extracción, las cáscaras fueron limpiadas y secadas a 35°C por 24 horas.

Para la maceración sucesiva, se pesaron 200 g de cáscara seca y se adicionaron 400 ml de éter de petróleo. Se maceró durante 48 horas a temperatura ambiente y y se protegió de la luz. Posteriormente se filtró el extracto obtenido, se concentró en vacío hasta alcanzar un volumen de 200 ml y luego el residuo sólido se evaporo al ambiente bajo cabina de extracción. La maceración se repitió utilizando un solvente de extracción diferente en cada oportunidad (cloroformo, acetato de etilo y agua). Para la maceración etanólica se pesaron 200 g de muestra seca y se adicionaron 400 ml de etanol al 70 %, se maceró durante 48 horas a temperatura ambiente y en sombra. A continuación, se filtró y el extracto etanólico se concentró hasta un volumen final de 200 ml (extracto crudo). Se tomaron alícuotas del extracto crudo y se concentraron nuevamente hasta obtener 4 diferentes factores de concentración: 1, 2, 5, 10 (Tabla 1). Se repitió el procedimiento de extracción hasta obtener un nuevo extracto crudo que se usó en el proceso de fraccionamiento. Todos los extractos obtenidos fueron almacenados en refrigeración (0 °C) hasta su uso.

2.3. Ensayos de actividad antimicrobiana

El ensayo de actividad antimicrobiana usado fue una adaptación del método de difusión en discos o antibiograma propuesto por Clinical and Laboratory Standars Institute (2012) que consistió en las siguientes etapas.

Preparación del inóculo por método directo de inoculación a partir de colonia aislada: se suspendieron colonias de una placa de cultivo no selectivo de 18 horas de incubación en caldo nutritivo. La densidad de la suspensión se ajustó a 0,5 de la escala McFarland.

Inoculación en placas: se sembró por hisopado en las placas de agar Muller-Hilton el inóculo previamente preparado. La siembra se realizó dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de densidad del inóculo.

Aplicación de los discos con antimicrobianos en las placas inoculadas: se realizaron discos de papel filtro de 6mm de diámetro, se esterilizaron y posteriormente fueron impregnados con las diferentes concentraciones de los extractos y las fracciones. Se colocaron los discos con antimicrobiano sobre la superficie inoculada de la placa con la ayuda de una pinza estéril aplicando ligera presión y a una distancia adecuada.

Incubación de las placas y lectura de resultados: las placas invertidas fueron incubadas por 18 horas a 35°C. Cumplido este tiempo, se midieron los halos de inhibición generados. Las lecturas se aproximaron al valor entero en milímetros más cercano.

2.4. Fraccionamiento

En el método de maceración sucesiva, los compuestos presentes en la cáscara de banano fueron extraídos en función de la polaridad del solvente. A cada uno de los extractos obtenidos se le considera también como fracción: el extracto o fracción etérea, extracto o fracción clorofórmica, extracto o fracción de acetato de etilo y el extracto o fracción acuosa. El extracto etanólico logrado por el método de maceración etanólica se dividió en cuatro partes iguales, cada una de las cuales fue fraccionada mediante solventes de diferente polaridad.

Fraccionamiento con cloroformo: se llevó una porción del extracto a un pH de 2-3 usando una solución de HCl al 5%. Se adicionó NaOH al 20% gota a gota hasta alcanzar un pH entre 10 a 12. Se transfirió el extracto alcalinizado a un embudo de separación. Se extrajo con cloroformo mediante 3 lavados, separando la fase orgánica cada vez. Con un evaporador rotatorio, se concentró la fase orgánica hasta sequedad y se reconstituyó con agua estéril para obtener la fracción A. A partir de la fracción A se realizaron las pruebas de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

Fraccionamiento con éter de petróleo: se transfirió una porción del extracto a un embudo de separación y se extrajo con éter de petróleo, realizando 3 lavados con el solvente y separando la fase orgánica cada vez. Se guardó la fase acuosa para su posterior extracción. Mediante un evaporador rotatorio, se concentró la fase orgánica hasta sequedad y se la reconstituyó con agua estéril. Así se obtuvo la fracción B, a partir de la cual se realizaron las pruebas de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

Fraccionamiento con metanol/agua (50/50): se maceró la fase acuosa previamente obtenida durante 24 horas con una mezcla de metanol/agua (50/50). Se filtró al vacío, el líquido filtrado obtenido se concentró a sequedad y se reconstituyó con agua estéril, obteniendo de esta forma la fracción C. Al residuo sólido logrado de la filtración al vacío se redisolvío en cloroformo, se concentró a sequedad y reconstituyó con agua estéril, de esta forma se obtuvo la fracción D. A partir de estas dos fracciones se realizaron las pruebas de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

Fraccionamiento con acetato de plomo y cloroformo: se añadió gota a gota una solución de acetato de plomo al 20% sobre una porción del extracto hasta que no se apreció la formación de precipitado. Se filtró por gravedad, desechó el precipitado y al filtrado se extrajo con cloroformo, realizando 3 lavados con el solvente y separando la fase orgánica cada vez. Se filtró el extracto clorofórmico mediante sulfato de sodio anhidro, se concentró el filtrado obtenido a sequedad y se reconstituyó con agua estéril. Se obtuvo entonces la fracción E, a partir de la cual se realizaron las pruebas de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

2.5. Tamizaje fitoquímico

Las fracciones obtenidas por el método de maceración sucesiva fueron analizadas para la identificación de los grupos fitoquímicos presentes (alcaloides, terpenos, esteroides, antocianos, flavonoides, taninos, saponinas, etc.) mediante ensayos cualitativos específicos, como se detalla en la Tabla 2. Las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo (maceración etanólica) fueron analizada según los ensayos propuestos en la Tabla 3.

Tabla 2 Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a través del primer método de extracción 

Fuente: Adaptado de ^{Matos (2009})

2.6. Análisis estadístico

Las diferentes concentraciones obtenidas a partir del extracto crudo de maceración etanólica fueron usadas en el ensayo de actividad antimicrobiana. Las determinaciones se realizaron por triplicado y con los halos de inhibición obtenidos se realizó un análisis de varianza (ADV) utilizando una significación estadística del 95%. Los factores en estudio para los ensayos de actividad microbiana en las diferentes concentraciones del extracto crudo (Tabla 1) fueron: tipo de bacterias, concentraciones del extracto crudo y la interacción entre ellos. Al considerar que la concentración 4 del extracto etanólico crudo (C4) generó una mayor inhibición en el crecimiento de las bacterias, el extracto etanólico crudo se fraccionó nuevamente, concentró y reconstituyó mediante el mismo procedimiento descrito anteriormente (sección 2.4), obteniéndose el factor de concentración de 10. A partir de estas fracciones se repitieron el ensayo de actividad antimicrobiana y el ADV, este último para los factores tipo de bacterias, tipo de fracción e interacción entre ambos. En caso de significación estadística de los factores, se realizó la prueba de Tukey para los promedios de los efectos obtenidos con las distintas concentraciones y fracciones.

Tabla 3 Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a partir del extracto crudo 

3.1. Análisis bromatológico

Los resultados generales del análisis bromatológico de las muestras evaluadas se muestran en la Tabla 4. El agua constituyó el principal componente de la cáscara de banano en aproximadamente un 89 %. Los sólidos totales, que incluyen grasa, proteína, ceniza y carbohidratos, conformaron aproximadamente una décima parte del peso total de las cáscaras de banano analizadas. La fracción sólida aprovechable contiene en promedio baja cantidad de grasa 0.47 %, mientras que el 0.74 % correspondió a proteína y el 1.55 % de cenizas, donde se encuentran los macro y micronutrientes., lo cual indica un considerable potencial con fines nutricionales. El porcentaje de carbohidratos fue en promedio el 8.3 %, donde se encuentra una gran cantidad de compuestos orgánicos también aprovechables.

3.2. Ensayos de actividad antimicrobiana

Del ADV en las concentraciones del extracto crudo, se obtuvo para el factor tipo de bacterias una ligera tendencia (P = 0.09) de una diferencia entre los promedios de medición de los halos de inhibición debida al tipo de microorganismo analizado. Para el factor concentraciones del extracto etanólico crudo, se encontraron diferencias altamente significativas entre concentraciones (P < 0,001). Finalmente, no se encontraron evidencias de una interacción entre los dos factores (P = 0,11).

La prueba Tukey HSD para los promedios de las concentraciones del extracto etanólico crudo y su efecto en el halo de inhibición, (Tabla 5) perimitió identificar 3 grupos homogéneos. En el primer grupo se ubicaron el blanco y las dos concentraciones de extracto más bajas C1 y C2, en el segundo grupo la concentración C3 y en el último, la concentración C4, que fue la que produjo la máxima inhibición en el crecimiento de los microorganismos analizados.

En forma similar, se observó una diferencia altamente significativa (P < 0,001) entre los promedios de las mediciones de los halos de inhibición debida a las fracciones del extracto (C4), sin embargo, no se observaron diferencias entre los tipos de microorganismos sometidos al ensayo (P = 0,42), ni se constató una interacción entre los dos factores (P = 0,09). Los resultados obtenidos de la prueba Tukey HSD (Tabla 6), mostraron tres grupos homogéneos de promedios. Las fracciones A, D y E se ubicaron en el primer grupo, las fracciones D, E y C en el segundo y las fracciones C y D en el tercer grupo, en el mismo que se verificó una mayor inhibición del crecimiento de las bacterias estudiadas.

3.3. Tamizaje fitoquímico

En las cuatro fracciones logradas mediante el método de extracción sucesiva se llevaron a cabo las pruebas cualitativas de identificación de grupos fitoquímicos. La Tabla 7 recoge los resultados positivos obtenidos. En la fracción conseguida con éter de petróleo (FEP) se identificó la presencia de compuestos del tipo aceites/grasas y esteroles, así como la ausencia de alcaloides y lactonas. En la fracción clorofórmica (FCF), al igual que en la fracción etérea, se identificaron compuestos grasos y esteroles pero en una cantidad menor, mientras que los taninos se encontraron ausentes. Se identificó la presencia de esteroles y la ausencia de flavonoides y taninos en la fracción alcanzada usando acetato de etilo como solvente de extracción. En la fracción acuosa no se identificaron flavonoides, ni alcaloides, sin embargo, se reconoció la presencia de taninos y saponinas.

Tabla 7 Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones obtenidas por el método de maceración sucesiva 

De manera similar se ejecutaron pruebas cualitativas para la identificación de grupos fitoquímicos en las fracciones obtenidas a partir del extracto por maceración etanólica y los resultados positivos se resumen en la Tabla 8. Las pruebas realizadas sobre la fracción A indicaron la ausencia de alcaloides, mientras que los resultados obtenidos de la fracción B confirmaron la presencia de esteroles y triterpenos. En la fracción C se identificaron varios grupos fitoquímicos: flavonoides, saponinas y taninos no hidrolizables y condensados, sin embargo, en la fracción D, que fué analizada por las mismas pruebas cualitativas, no se identificó ninguna familia de estos compuestos. Las pruebas de antocianos y antraquinonas dieron resultados negativos en las fracciones C y D. Se descartó la presencia de glicósidos cardiotónicos y compuestos con agrupamiento lactónico como las cumarinas en la fracción E.

Tabla 8 Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones logradas por el método de extracción etanólica 

Al comparar los resultados de las pruebas fitoquímicas realizadas en los dos grupos de fracciones, alcanzadas por diferentes métodos de extracción, se evidenció el reconocimiento de grupos de compuestos fitoquímicos similares. Adicionalmente, se llevaron a cabo análisis por la técnica de cromatográfia en capa fina y sus resultados concuerdan con los correspondientes a las pruebas screening para la identificación de las familias de compuestos fitoquímicos. En las fracciones B y C se reconoció la presencia de esteroles y flavonoides respectivamente. Al revelar las placas obtenidas para esteroles y flavonoides se observaron 4 manchas en cada una de ellas. Para la identificación de flavonoides también fueron visualizadas las placas en UV y fluorescencia en donde se consideraron los colores generados, adicionalmente se calcularon los factores de retención o R_f, y los resultados se exponen en la Tabla 9.

Tabla 9 R_f obtenidos de la cromatografía de capa fina de las fracciones del extracto por maceración etanólica  

Hasta nuestro mejor conocimiento en Ecuador no existe registro de otras investigaciones realizadas sobre la composición bromatológica de la cáscara de banano Musa paradisiaca producida en el país, razón por la cual los resultados obtenidos aportan a datos nacionales. Adicionalmente, el conocimiento del contenido general de los diferentes nutrientes presentes en la cáscara constituye la base para el planteamiento de posibles aplicaciones que con futuras investigaciones permitirá finalmente otorgarle usos innovadores a este subproducto. Los grupos de compuestos fitoquímicos identificados en los extractos se caracterizan por sus propiedades bioactivas y su potencial utilidad en la industria, no obstante los resultados obtenidos difieren de los generados en otras investigaciones. ^{Niamah (2014}) identificó, en el extracto metanólico crudo logrado por maceración, la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides, saponinas, glicósidos y la ausencia de taninos. ^{Mordi et al (2016}) obtuvieron un extracto metanólico a través del método Soxhlet en el cual identificaron terpenos, taninos, esteroles y compuestos fenólicos en trazas, reconociendo además la ausencia de flavonoides. ^{Ahmed (2015}) identificó la presencia de saponinas, carotenoides, compuestos fenólicos, taninos y ausencia de alcaloides en el extracto etanólico crudo. Los diferentes métodos de preparación de muestra, extracción y los solventes usados son los posibles responsables de la discrepancia en los resultados, así como las variaciones en los metabolitos que generan las plantas dependiendo de las condiciones de producción (suelo, riego, clima, plagas, agroquímicos, entre otros).

Varias investigaciones con respecto a la actividad antimicrobiana de la cáscara de banano han sido realizadas en todo el mundo, no obstante, existe una notable diferencia entre los datos generados en esta investigación y los existentes. ^{Chinnappan, et al (2013}), concluyó que la cáscara de banano posee actividad antimicrobiana significantiva sobre Aeromona hydrophyla, Staphylococcus aureus y Pseudomona citrii, pero actividad nula frente a enterobacterias como Escherichia coli, Shigela sp., Klebsiella pneumoniae y Salmonella thyphi y thypinurium. ^{Niamah (2014}), evidenció una elevada actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus, Lactobacillus casei, Bacillus sp., y una actividad menor sobre Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa. ^{Ahmed (2015}), reportó una elevada actividad sobre Staphylococcus aureus, P. aeruginosa así como en los hongos Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium digitatum y Fusarium oxysporum; mientras que la actividad antimicrobiana sobre Escherichia coli fue menor. ^{Mordi et al (2016}), identificó una elevada actividad antimicrobiana sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Klebsiella spp., y Pseudomona spp. Es importante recalcar que, pese a las investigaciones mencionadas, las cuales se realizaron en banano maduro de la misma especie, la fisiología de las plantas durante su desarrollo se ve afectada directamente por factores como el tipo de suelo, clima, cantidad de lluvias, época del año en la cual se produce, etc. Por lo tanto, existirán diferencias en la composición de los compuestos fitoquímicos presentes lo cual se traduce en variaciones en sus propiedades bioactivas, lo cual explicaría la discrepancia de los datos de actividad antimicrobiana. (^{Pavarini , D., Pavarini, S., Niehues, M., & Lopes, N., 2012}).

La existencia de actividad antimicrobiana y la presencia de grupos fitoquímicos específicos en el extracto de la cáscara de banano Musa paradisiaca, sustentan y justifican una posible utilización en la industria como producto biológico bactericida y es una alternativa sostenible, ecológica e innovadora, que orientándola adecuadamente permitiría inclusive enfrentar de alguna forma el cada vez más preocupante problema de resistencia a los antimicrobianos. Por lo tanto, investigaciones específicas podrían ser realizadas en este campo utilizando subproductos de banano producido en Ecuador.