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El cáncer es un problema a nivel mundial en el sector público debido a que representa la segunda causa de muerte. Dicha enfermedad se debe a la multiplicación sin control en las células, logrando así una invasión en los distintos tejidos del cuerpo, pero a pesar de ser una enfermedad crónica degenerativa se puede curar con un tratamiento temprano 1.
Dentro de este grupo de enfermedades existe la afección en el cáncer de mama el cual se enfocará esta investigación, el mismo que es la segunda causa de muerte dentro de este grupo solo superada por el cáncer de piel 3. Como podemos observar en la Figura 1 también es la afección que lidera con el número de pacientes en ambos géneros por lo que es necesario enfocar estudios que mejoren esta estadística.
La aplicación clínica enfocada en el cáncer de mama consiste en la combinación de antineoplásicos, que básicamente son tipos de fármacos empleados para combatir diferentes tipos de cáncer, pero por lo general se usan en este tipo de afecciones 4. Estos medicamentos antineoplásicos son administrados en ciclos siguiendo un intervalo de tiempo determinado, esto va a depender del estadio de enfermedad y sobre las especificaciones del tumor 5.
Según Macas Victoria 6, existen alternativas de combinaciones para el tratamiento del cáncer de mama y las que se usan más son: Ciclofosfamida, metrotrexato y 5-fluorouracilo (CMF); Doxorrubicina, Ciclofosfamida (AC); Docetaxel, Ciclofosfamida (DC); Ciclofosfamida, Doxorrubicina, 5-fluorouracilo (CAF). El DOX el cual se puede observar dicha estructura en la Figura 2, un producto derivado del antibiótico rodomicina B, es un agente citotóxico muy utilizado en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, famoso por su potente actividad antitumoral. Por lo tanto, ha tenido un papel esencial en el tratamiento de esta enfermedad gracias a su capacidad para inhibir la proliferación celular y alterar la replicación del ADN en las células tumorales. No obstante, la doxorrubicina presenta efectos secundarios en los cuales los que más prevalecen son la toxicidad cardíaca, la toxicidad hematológica y la alopecia, por lo que su uso se ve restringido y dosificado en la práctica clínica 7.
Por lo tanto, este estudio estará enfocado en proteínas asociadas como el cáncer de mama como son el PARP1 (Poli (ADP-ribosa) polimerasa 1), que juega un papel crucial en la reparación de rupturas de ADN de cadena sencilla y de cadena doble. El CDK2 (Cinasa dependiente de ciclina 2), es una proteína que afecta al ciclo celular en donde se relaciona con la multiplicación de las células cancerígenas. Y por último la αPI3K (Alfa Fosfatidilinositol 3-cinasa), dicha proteína interviene en las funciones biológicas esenciales como pueden ser los procesos de la supervivencia celular y sus proliferaciones, estas proteínas fueron escogidas debido a que influyen directamente en el cáncer de mama y que ya son estudiados en este ámbito 8.
Los efectos secundarios de los componentes frente a estas proteínas se ven relacionados con el valor de la energía de afinidad en la interacción complejo-ligando, uno de los fundamentos de diseño de afinidad define que si su interacción obtiene un valor más negativo es efectivo con la proteína a estudiar 9.
Dicho todo esto se prioriza los estudios en el “Structure-based drug design” (SBDD) el cual es de gran importancia en el sector de salud, en la búsqueda de estos nuevos medicamentos se ha planteado diversos métodos el cual el más prometedor son los métodos computacionales, una de estas técnicas son los bioisósteros el cual son modificaciones que tienen una estructura química diferente, pero que posean propiedades biológicas y farmacológicas muy similares 10.
En la actualidad se usa servidores de datos para analizar todas estas modificaciones bioisostérica como es la herramienta MolOpt de Xundrug en donde usa modelos generativos profundos y comparación de similitud de la molécula que deseamos modificar 11.
Para el análisis de interacción entre el complejo-ligando existe varias herramientas computacionales, en donde el más conocido es el acoplamiento molecular realizado en AutodockTools, este programa nos permite llevar a cabo un acoplamiento molecular, ya sea conociendo el sitio de unión de la proteína o sin conocerlo. Esto nos permite diseñar una caja de búsqueda para un acoplamiento molecular dirigido o realizar un acoplamiento ciego, que considera toda la proteína. Este método de acoplamiento molecular es de gran importancia y actualmente el más utilizado en el SBDD ya que nos va a permitir predecir el modo de unión experimental y la energía de afinidad en la interacción proteína-ligando 12.
Al realizar el análisis de los resultados planteados en los diseños de los bioisósteros se busca obtener que al menos uno de los bioisósteros planteados mostrará una energía de afinidad significativamente menor que la de la doxorrubicina en su interacción con al menos una de las proteínas PARP1, CDK2 y αPI3K. Esto se enfocará en sus energías de afinidad ya que es uno de los métodos utilizados en el diseño de nuevos fármacos basado en estructuras.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de proteína y ligando.
La obtención de proteínas cristalizadas con alta calidad es fundamental para el éxito del estudio de acoplamiento molecular. Se seleccionaron proteínas con resoluciones adecuadas de los complejos proteicos PARP1 (PDB ID: 5HA9), CDK2/cyclin A + AZD5438 (PDB ID: 6GUE) 13 y αPI3K inhibitor 10-5429 (PDB ID: 7K6O) 14, descargándolas en formato PDB desde el Protein Data Bank (https://www.rcsb.org) 15, base de datos utilizada para la preparación de las proteínas a estudiar. Estas proteínas serán utilizadas en el estudio de interacción con el componente de doxorrubicina y sus bioisósteros. La estructura del componente a modificar doxorrubicina fue obtenida de la base de datos de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) 16.
La conformación obtenida en SDF (Structure Data File) se preparó y se optimizo en el programa de Avogadro 17 agregando cargas y delimitando el pH en 7,4. La optimización se realizó con el forcé field de MMFF94 con un algoritmo de descenso más pronunciado.
Para la preparación del archivo de mol2 a formato de pdb se usó la herramienta de OpenBabel 18 ya que es un sistema intuitivo y muy utilizado en investigaciones de docking molecular.
Estudio de Acoplamiento Molecular
El Acoplamiento Molecular es un método computacional muy usado en la química farmacéutica y en el diseño de nuevos fármacos, este procedimiento tiene el objetivo de realizar la interacción entre dos moléculas para analizar su energía de interacción 19.
Esta técnica se realizó de la mano del programa de AutodockTools el cual es un conjunto de herramientas automatizado para acoplar ligandos de proteínas. Está diseñado para predecir cómo interactuarán las proteínas con moléculas pequeñas, como moléculas de fármacos y sustratos 20. Las aplicaciones de esta herramienta son amplias e incluyen diseño de fármacos basado en estructura, optimización de cables moleculares, acoplamiento proteína- ligando, acoplamiento proteína-proteína, análisis y verificación de mecanismos moleculares 20. Este método se realizó una vez obteniendo los archivos en formato pdb y conociendo sus sitios activos el cual se realizó en DoGSiteScorer 21 en el cual nos permite ingresar la proteína a estudiar y nos brinda información de los sitios activos presentes, dicha información nos ayudara para la preparación del grind box como se puede observar en la Imagen 2. Una vez teniendo todo esto en cuenta se procede a preparar la proteína ya sea eliminando los residuos de agua y eliminando los elementos que no vamos a estudiar quedando las cadenas 6GUE-Chain A, 5HA9-Chain B, 7K60-Chain B 8, también necesitaremos eliminar las moléculas de HetAtom. Se procedió también a agregar los hidrógenos no polares en conjunto con las cargas de kollman y la asignación de los tipos AD4, realizado la preparación de la proteína la importamos en formato pdbqt, para el ligando necesitaremos definir su torsión para luego obtener el archivo en pdbqt.
Una vez obtenido los archivos de pdbqt de la proteína y del ligando podremos realizar el acoplamiento con las herramientas de Autogrid4 y Autodock4. Este procedimiento se realizó de forma estándar solo configurando el número de evaluaciones máxima el cual se ha decidido trabajar en “Log” ya que es el que nos proporciona un valor de 25 millones de evaluaciones en cada conformación realizada.
Obtención y Selección de Bioisósteros.
Para generar los bioisósteros de doxorrubicina, se utilizó la herramienta MolOpt en línea 11. Se seleccionó la estructura SMILES de la doxorrubicina desde PubChem y se cargó en MolOpt para identificar los puntos de unión susceptibles de modificación, enfocándose en el grupo amino en el anillo del azúcar y el grupo metilo, con el objetivo de aumentar la lipofilia y mejorar la energía de afinidad. La herramienta MolOpt generó una lista de bioisósteros, que se descargó en formato Excel para su análisis posterior.
Los bioisósteros seleccionados para estudio se filtraron utilizando la regla de Lipinski, evaluando parámetros como peso molecular, lipofilia, número de donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno, y accesibilidad sintética. Esta selección se realizó considerando que los valores se acercaran a los recomendados por la regla, lo cual asegura que los compuestos tengan un perfil farmacológico adecuado.
III. RESULTADOS
Bioisósteros
Uno de los objetivos en este trabajo es lograr diseñar mejores bioisósteros en relación con el fármaco de la doxorrubicina, por lo que se procedió a la obtención de estos mismo mediante técnicas de base de datos en MolOpt, esta herramienta nos permitió libertad de modificación en diferentes puntos de la estructura en este estudio se enfocó en el grupo amino.
Gracias a la herramienta de MolOpt nos proporcionará un total de 94 bioisósteros con diversas propiedades lo cual nos ayudará para una próxima selección, esto se realizará mediante pruebas de lipinski 22 ayudando a filtrar datos y obteniendo 5 mejores componentes como se puede observar en la Tabla 1.
Estos bioisósteros obtenidos son los 5 mejores de los 94 proporcionados por la herramienta enfocados en el grupo funcional amino como podemos observar en la Figura 4. Aquí podemos observar las mejores estructuras consideradas análogas por las reglas de bioisosterismo con su estructura original que es el componente de la doxorrubicina (DOX).
Diseño de caja
En la Tabla 2 se reporta el diseño final que se obtuvo para realizar correctamente el tipo de caja para cada proteína que se va a estudiar gracias a la determinación del sitio activo, aquí se evidencia los datos para la conformación de ubicación y volumen en sus 3 ejes para la herramienta de Grid Box dentro del programa de Autodocktools. Esta información está dispuesta por el tipo de proteína 6GUE, 5HA9 y 7K60 dispuesta por sus 3 ejes que son X Y Z y con sus valores de npts (número de puntos por lado), center (ubicación del centro de la caja) y por último su spacing (densidad dentro de la caja).
Acoplamiento Molecular
El análisis de docking molecular permitió evaluar las interacciones entre la doxorrubicina y sus bioisósteros con las proteínas PARP1 (5HA9), CDK2 (6GUE) y αPI3K (7K60). Las energías de afinidad obtenidas, presentadas en la Tabla 3 revelan variaciones significativas entre los diferentes bioisósteros y la doxorrubicina original.
Para la proteína PARP1, el bioisóstero B5 mostró la mejor afinidad con una energía de -11,62 kcal/ mol, superando incluso a la doxorrubicina que registró una afinidad de -11,29 kcal/mol. Este resultado sugiere que B5 podría tener un potencial terapéutico superior al de la doxorrubicina en el tratamiento de cánceres en los que PARP1 es un objetivo terapéutico relevante.
En el caso de la proteína CDK2, el bioisóstero B4 presentó una afinidad ligeramente superior a la de la doxorrubicina, con valores de -8,29 kcal/ mol y -7,53 kcal/mol, respectivamente. Esto indica que B4 podría ser un candidato más eficaz en la inhibición de CDK2, lo que es crucial para el control del ciclo celular en células cancerosas.
Tabla 3 Energías de Afinidad de la Doxorrubicina y sus Bioisósteros frente a las proteínas PARP1 (5HA9), CDK2 (6GUE) y αPI3K (7K60). Elaborado por Guaillazaca, E.
Sin embargo, para la proteína αPI3K, la doxorrubicina mostró una mayor afinidad que todos los bioisósteros evaluados. La energía de afinidad más baja entre los bioisósteros fue de -6,38 kcal/mol (B5), mientras que la doxorrubicina presentó un valor de -7,16 kcal/mol. Estos resultados sugieren que, al menos para αPI3K, la doxorrubicina sigue siendo el compuesto más efectivo entre los estudiados.
Conformaciones e interacciones óptimas con sus mejores bioisósteros.
Una vez obtenidos los resultados del acoplamiento, se realizó un análisis detallado de las interacciones ligando-proteína. Existen diversos métodos para el análisis de los archivos DLG (Docking Log File) pero en esta investigación se usó AutoDock Tools (20), LigPlot+ (23) y PyMol (24) para evaluar la conformación con menor energía de afinidad y las interacciones clave que contribuyen a la estabilidad del complejo necesitaremos el archivo pdb de la mejor conformación en cada una de las interacciones por lo que extraemos el pdbqt en AutodockTools, proseguido a esto se convertirá el archivo de pdbqt a pdb para ingresar a las herramientas computacionales. Se visualizaron y ajustaron las interacciones en 3D en los programas de PyMol, para las visualizaciones en 2D nos apoyamos en el programa de LigPlot+ y se guardaron las imágenes resultantes para su inclusión en el reporte final. Este análisis permitió identificar las mejores conformaciones y las interacciones críticas que podrían contribuir a la eficacia de los bioisósteros en inhibir las proteínas PARP1, CDK2, y αPI3K.
Figura 5 Conformaciones óptimas de las proteínas con sus mejores bioisósteros. A)5HA9B5, B)6GUEB4, C) 7K60B5obtenidas en AutodockTools. Elaborado por Guaillazaca, E
Figura 6 Conformaciones óptimas de las proteínas con sus mejores bioisósteros. A)5HA9B5, B)6GUEB4, C) 7K60B5. Elaborado por Guaillazaca, E.
En las Figuras 2, 3 son las respectivas conformaciones extraídos desde AutodockTools y Pymol, aquí se puede evidenciar las interacciones que tuvieron cada bioisósteros optimo y la doxorrubicina en forma de cintas y en forma de tubos respectivamente.
Figura 7 Interacción Molecular en 2D de cada conformación óptima entre las proteínas y su mejor bioisóstero. A)5HA9B5, B)6GUEB4, C) 7K60B5. Elaborado por Guaillazaca, E.
En la Figura 4 se observa de mejor manera las interacciones que se obtienen entre la proteína y el ligando, teniendo que las interacciones en A) la proteína 5HA9 interactúa con B5 resultando interacciones con residuos de TYR28, ASN106 Y GLU102. En B) se asocia la proteína con 6GUE con su ligando B5 resaltando interacciones con los residuos ASP145, ASN132, LYS33, LYS129 y LEU83. Finalmente, en C) tenemos las interacciones con la proteína 7K60 que interactúa con B5 mostrando interacciones con ALA47 y GLN. Todas estas interacciones se dan mediante enlaces de hidrógenos, y las no mencionadas son las interacciones hidrofóbicas que hay en las conformaciones.
IV. DISCUSIÓN
El método del acoplamiento molecular es una herramienta en la Química Computacional muy útil a la hora del desarrollo de nuevos fármacos, en donde nos permite predecir la Energía de Afinidad y sus modos de interacciones entre proteína-ligando o proteína-proteína 25. En este estudio se realizó una obtención de bioisósteros el cual son modificaciones estructurales en el componente conservando sus propiedades fisicoquímicas similares, esto nos permite diseñar nuevos fármacos que pueden superar en eficiencia los ya planteados 26. Estos componentes modificados estructuralmente se obtuvieron de la herramienta computacional MolOpt, el cual es un servicio en línea que nos brinda Xundrug 11, esta herramienta es un sistema de remplazo siguiendo los lineamientos bioisostéricos para diseño de nuevos fármacos en silico, este remplazo se realiza mediante un gran sistema de datos en donde genera comparación de similitudes y modelos generativos profundos 11. Esta herramienta nos brindó un total de 94 bioisósteros, el cual se procedió a la filtración de datos gracias a la regla de lipinski dicha regla nos sirve para escoger los 5 mejores bioisósteros siguiendo los parámetros de diseño de fármacos, esta regla nos dice que si los compuestos analizados que caigan fuera de los parámetros planteados tendrán menos probabilidades de ser óptimas para el uso farmacológico 22. Con la regla de lipinski hemos filtrado los 94 datos que nos da la herramienta MolOpt a los 5 mejores denominándolos como B1(004), B2(017), B3(006), B4(025) y B5(031), lo cual estos 5 bioisósteros serán clave para la investigación de acoplamiento molecular que de acuerdo a los resultados de la interacción complejo- ligando que se obtuvieron en el programa de Autodock se evidencio que de los 5 bioisósteros evaluados y comparados con el componente de la doxorrubicina, se obtuvieron un total de 33,3 % de bioisósteros óptimos y un 50 % de deficientes incluyendo a los valores de la doxorrubicina como equivalentes, esto refiere y acepta la hipótesis alternativa planteada en este trabajo de investigación dando como resultado que al menos uno de los bioisósteros tiene una energía de afinidad menor que la doxorrubicina con cada proteína PARP1, CDK2 y αPI3K. Estos compuestos se escogieron de acuerdo con el enfoque de 8, el cuál califica los mejores fármacos dependiendo del resultado mínimo de la energía de afinidad de cada compuesto a estudiar, siguiendo este planteamiento se denominó óptimo a los compuestos 5HA9-B1, 5HA9-B4, 5HA9-B5, 6GUE-B1, 6GUE-B2 y 6GUE-B4. Siguiendo estos parámetros, se identificaron 4 bioisósteros de un total de 5 como óptimos, dependiendo de la proteína con la que interactúan. Para la proteína 5HA9, se seleccionó el compuesto B5 con un valor de afinidad de -11,62 kcal/mol, en comparación con los -11,29 kcal/mol de la doxorrubicina. En el caso de la proteína 6GUE, se calificó como óptimo al compuesto B4, con un valor de -8,29 kcal/mol, frente a los -7,53 kcal/mol de la doxorrubicina. En el caso de la proteína de la 7k60 el componente de la doxorrubicina se sigue calificando como óptima con un valor de -7,16 comparándolo con -6,38 de B5 que fue el mejor de su grupo. Cabe recalcar lo visto en el estudio de 8, en donde también evalúan los fármacos con otras técnicas computacionales aparte del acoplamiento molecular aplicando dinámica molecular el cual nos ayuda a entender de mejor manera las interacciones que surgen entre el complejo-ligando con valores de desviación cuadrática media (RMSD). Por lo tanto, tras analizar las energías de afinidad de las propuestas farmacológicas, se seleccionaron para estudios posteriores los bioisósteros dirigidos a B5 con la proteína 5HA9, B4 con la proteína 6GUE, DOX con la proteína 7K60, y el bioisóstero general B1, que mostró resultados destacados en las proteínas 5HA9 y 6GUE al compararse con la doxorrubicina.
V. CONCLUSIONES
Este estudio demostró que la modificación estructural de la doxorrubicina para generar bioisósteros puede mejorar la energía de afinidad hacia proteínas clave en la terapia del cáncer de mama, como PARP1 y CDK2. En particular, los bioisósteros B5 y B4 mostraron un potencial terapéutico superior en las proteínas PARP1 y CDK2 respectivamente, lo que sugiere que podrían ser candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos tratamientos dirigidos para dichas proteínas, aun así, se destacó el bioisósteros B1 en las dos proteínas con una peor energía de afinidad que B5 y B4, pero mejor que el componente de la doxorrubicina en las dos proteínas mencionadas. Por lo tanto, evidencia que 4 bioisósteros se consideraron óptimos o mejores que el componente de la doxorrubicina en base a sus energías de afinidades evaluados en cada proteína respectivamente. Sin embargo, los resultados también indicaron que no todas las modificaciones conducen a una mejora del componente a estudiar, como se confirmó en el caso de la proteína αPI3K, donde la doxorrubicina original sigue siendo el compuesto más efectivo con una diferencia de 0,78 kcal/mol al mejor de los bioisósteros con dicha proteína. Estos hallazgos subrayan la importancia de un enfoque específico en el diseño de bioisósteros, ya que las mejoras en la afinidad y la eficacia pueden variar considerablemente según la proteína objetivo. A pesar de eso, esta técnica bioisostérica en el componente de la doxorrubicina se considera óptima para el desarrollo de nuevos fármacos enfocados en las proteínas PARP1, CDK2 y αPI3K. Estos métodos computacionales son de gran ayuda para el desarrollo de nuevos fármacos ya que nos ofrecerán ventajas significativas en comparación con los métodos convencionales, estas ventajas son en el ámbito económico y en el factor tiempo
