Muestreo y cultivo de algas Chlorophyta

Las algas Chlorophyta fueron aisladas a partir de muestras superficiales de 300 mL del agua de la laguna Limoncocha tomadas en tres puntos: punto 1, El Caño; punto 2, desembocadura de Playa Yacu; punto 3, Muelle. La toma de muestras se realizó en base a la Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 2176: muestreo de fitoplancton. Éstas fueron homogenizadas para formar una muestra compuesta y luego cultivadas en Nitrofoska foliar al 5% v/v durante 15 días, posteriormente se verificó la presencia de las algas mediante la prueba de Lugol ¹¹.

Figura 1 Puntos de muestreo en la laguna de Limoncocha. 

El muestreo del agua residual procedente del camal municipal del cantón Shushufindi se realizó en base a la Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 2176: muestreo de agua. Para la formulación de muestras compuestas de 5L, se tomó una muestra simple por cada hora de funcionamiento 7 en total, su volumen se determinó en relación al caudal medido por método de vertedero circular en el punto de descarga.

Pruebas de control de crecimiento y degradación de materia orgánica.

Las pruebas incluyeron seis distintos tratamientos de 1.8 L, con cinco repeticiones cada uno, en un fotobiorreactor tubular discontinuo con un fotoperiodo de 12 horas, lámparas led de 800 Lux, a una temperatura de 22.38°C y un pH de 8.45.

Para el control de crecimiento se utilizó Nitrofoska foliar al 5% como medio de cultivo ¹², al que se adicionó el inóculo algal al 5% v/v ^12,13; el tratamiento dos (T2) recibió aireación y el tratamiento uno (T1) se mantuvo sin aireación.

Las pruebas de reducción de materia orgánica incluyeron cuatro tratamientos que utilizaron el agua residual del camal en dilución de 1:3 ^1,3; dos unidades experimentales fueron inoculadas con algas Chlorophyta al 5% v/v, un tratamiento sin aireación (T3) y otro con aireación (T4); y dos unidades experimentales sin inoculación de algas, un tratamiento sin aireación (T5) y otro con aireación (T6).

Medición de parámetros

Los valores de pH fueron monitoreados cada 24 horas utilizando el pH-metro Acumet XL150, considerando que el pH del agua residual fue de 8.44 ± 0.22, un valor óptimo para el cultivo de algas ¹³, no fue necesario el uso de un agente corrector. El pH inicial promedio de los cultivos con Nitrofoska foliar fue de 6.99 ± 0.05, por lo que se utilizó KOH al 10% para corregirlo.

El conteo diario en cámara de Neübauer permitió obtener las curvas de crecimiento y calcular la productividad celular ¹; se realizó la medición de parámetros fisicoquímicos para cada tratamiento hasta el día en el que se evidenciaba un decremento del número celular.

El registro diario de conductividad, sólidos disueltos totales (TDS) y temperatura se obtuvo mediante un multiparámetros KETOTEK.

Para la determinación de DBO5 se utilizó el método respirométrico 5210-B, el valor del nitrógeno total se obtuvo por el método de Kjeldahl, para la medición del nivel de fosfatos se utilizó el método de fósforo soluble en agua por ácido ascórbico 3500-D y para los sulfatos se usó el método 4-229-A. Estas mediciones se llevaron a cabo al inicio y al final del ensayo.

Análisis estadístico

Se realizó un ANOVA y una prueba de Tukey; para cada una de las pruebas se tomó un nivel de significancia del 5%.

Control del pH

Se recomienda un pH alcalino para el crecimiento óptimo de algas porque facilita la solubilidad de minerales como el calcio, hierro, magnesio, cobre y zinc, permitiendo una mejor absorción de nutrientes ¹³.

El agua residual presentó un pH inicial de 8.45 ± 0.22, y los tratamientos con Nitrofoska foliar registraron un pH inicial promedio de 8.42 ± 0.14, observándose una tendencia creciente en los tratamientos a lo largo del ensayo (Gráfico 1). Los valores promedio de pH medidos fueron: tratamiento cuatro (T4), 9.32 ± 0.17; tratamiento dos (T2), 9.28 ± 0.15; tratamiento uno (T1), 9.0 ± 0.1; tratamiento tres (T3), 8.89 ± 0.33; tratamiento seis (T6), 8.81 ± 0.13; y, tratamiento cinco (T5), 8.25 ± 0.10.

Los tratamientos que incluyen el inóculo de algas Chlorophyta y reciben aireación (T4 y T2) presentan el mayor incremento del valor de pH, sin diferencias significativas entre ellos, y los tratamientos con algas pero sin aireación (T1 y T3) muestran un incremento moderado del valor del pH, sin diferencias significativas entre ellos. Este efecto se debería a la actividad fotosintética de las algas por la asimilación del CO₂ del medio ¹⁴; el CO₂, al estar disuelto en agua, forma moléculas de ácido carbónico (H₂CO₃) que se disocia con gran facilidad en protones (H⁺) e iones bicarbonato (HCO₃-) (2), y estos a su vez se disocian en iones carbonato (CO₃ ²-) y protones (H⁺) (15).

La acidificación observada en el tratamiento cinco (T5), que no recibió el inóculo algal ni aireación, podría deberse a bacterias anaerobias; estos organismos generan energía mediante vías fermentativas principalmente, produciendo sustancias orgánicas como el ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético, butanol, etanol y acetona, cuya presencia causa la disminución del valor pH en el medio ¹⁶.

Gráfico 1 Evolución del pH promedio durante el ensayo 

Crecimiento celular

Se evaluaron los cuatro tratamientos a los que se aplicó el inóculo algal: los tratamientos uno (T1) y dos (T2), que utilizaron Nitrofoska foliar como medio para el crecimiento celular; y, los tratamientos tres (T3) y cuatro (T4), formulados a partir del agua residual.

Los tratamientos sin aireación presentan menor crecimiento celular y llegan a la fase de muerte más rápidamente que los tratamientos que se oxigenaron (Gráfico 2).

El tratamiento cuatro (T4) presenta la mayor productividad celular, con 41944 células/L/día a los 17 días, seguido por el tratamiento dos (T2), con 39061 células/L/día a los 14 días.

Los resultados demuestran que la oxigenación es un factor limitante por encima del contenido de nutrientes en el medio ¹⁷. La eficiencia de los tratamientos con aireación se debería a la complementación biológica entre las algas y bacterias presentes en el sistema; tanto nitrificantes como bacterias que degradan la materia orgánica del efluente en presencia de oxígeno, despidiendo dióxido de carbono.

Este dióxido de carbono junto con el incorporado gracias a la aireación es utilizado por las algas en su proceso metabólico, desprendiendo el oxígeno requerido por la biomasa bacteriana. Estos datos sugieren que las aguas residuales con elevado contenido de materia orgánica constituyen un medio eficiente para la producción de biomasa algal ¹⁸.

Gráfico 2 Crecimiento de las algas Chlorophyta 

Degradación de la materia orgánica

Se evaluaron los cuatro tratamientos formulados a partir del agua residual: tres (T3), cuatro (T4), cinco (T5) y seis (T6); considerando que el inóculo algal se aplicó únicamente a los dos primeros tratamientos citados.

La conductividad eléctrica (CE) y sólidos totales disueltos (TDS) permiten evaluar el consumo de iones metálicos y sales minerales presentes en el agua, elementos que intervienen en el proceso de fotosíntesis llevado a cabo por las algas ³¹, y cuyos valores se consideran requerimientos principales para el cultivo de algas ³⁰, afectando de forma directa a la diversidad y crecimiento de algas ²⁹.

El porcentaje promedio de reducción de la conductividad eléctrica (CE) fue: 4.22% en T3, 20.65% en T4, 20.32% en T5, y 43.76% en T6; en general, las bacterias consumen más iones que las algas durante la respiración celular, lo que explica el rápido descenso en T6 y T5 ¹⁹. Como se observa en el Gráfico 3, la CE tiende a disminuir en todos los tratamientos, lo que supondría también una reducción de los niveles de cloruros, nitratos, sulfatos, fosfatos, sodio, magnesio y calcio, principalmente ²⁰.

Gráfico 3 Comportamiento de la conductividad en cada tratamiento 

En función de la eficiencia en la reducción de sólidos disueltos totales (TDS), se tienen los siguientes resultados: tratamiento seis (T6), 56.93%; tratamiento cuatro (T4), 20.66%; tratamiento cinco (T5), 16.64%; y, tratamiento tres (T3), 8.84%. Como se observa en el Gráfico 4, el nivel de TDS tiende a disminuir en todos los tratamientos en el transcurso del tiempo, al igual que el efecto observado durante el monitoreo de la CE, lo que representa el descenso de la concentración de las sustancias inorgánicas y orgánicas contenidas en el medio en forma molecular, ionizada o en forma de suspensión micro-granular ²⁰, notándose una menor eficiencia en los tratamientos que no recibieron aireación.

Gráfico 4 Variación del nivel de TDS a lo largo de los tratamientos. 

Los niveles de fosfatos, nitrógeno total Kjeldahl y demanda bioquímica de oxígeno (DBO₅) del agua residual procedente del camal, exceden los límites establecidos en el Anexo 1 del Libro VI del Texto Unificado de Legislación Secundaria del Ministerio del Ambiente del Ecuador: Norma de calidad ambiental y de descarga de efluentes al recurso agua; 43 mg/L de fosfatos frente a un máximo de 10 mg/L, 47.8 g/L de nitrógeno total Kjeldahl con relación al límite de 15 mg/L y, 1676 mg/L correspondientes a la DBO₅ sobre 100 mg/L permitidos. El único parámetro que se encuentra dentro de la norma es el de sulfatos, con un valor de 429 mg/L respecto al límite permitido que es de 1000mg/L (21). La evaluación de la depuración del agua residual se centró en la evolución de estos parámetros mediante la aplicación de los cuatro tratamientos antes citados.

La tasa de reducción de la DBO₅ fue: 83.1% ± 5.9 en T4, 76.1% ± 4.4 T3, 50.4% ± 5.7 en T6, y 25.9% ± 5.1 en T5. Como se muestra en el gráfico 5, los tratamientos que incluyeron el inóculo algal (T4 y T3) demostraron ser los más eficientes en la disminución de los niveles de materia orgánica susceptible de degradación biológica, lo que se fundamenta en la complementación existente entre las algas y bacterias presentes en el sistema.

Las bacterias degradan la materia orgánica transformándola en agua y dióxido de carbono, con un incremento de biomasa, productos que son utilizados por las algas en su proceso metabólico tras el cual desprenden oxígeno que será requerido por estas especies bacterianas ²².

Gráfico 5 Porcentaje de reducción de DBO, Nitrógeno total, Fosfatos y Sulfatos. 

En cuanto a los niveles de nitrógeno total Kjeldahl, se observa que el tratamiento cuatro (T4) logra una reducción de 63.1% ±2.3, seguida de T3, con 52.8% ± 5.3; T6, con 33.3% ± 7.1; y, finalmente T5, con 14.9% ± 6.6 (Gráfico 5). La eficiencia de T4 se atribuiría al crecimiento de las Chlorophyta considerando que el nitrógeno es uno de los principales requerimientos nutricionales de las algas.

El estado de este elemento en el cultivo es importante para la productividad de biomasa ²⁰; la diferencia en los porcentajes de reducción con respecto a otros estudios se debería a que algunas formas de nitrógeno no pudieron ser asimiladas por las algas, debido a las condiciones de cultivo y a la variedad de especies presentes ^{(17, 23, 24)}.

El porcentaje promedio de reducción de fosfatos en los diferentes tratamientos se muestra a continuación: T4, 66.5% ± 7.7; T3, 48.0% ± 6.6; T6, 29.7% ± 7.6; y T5, 13.3% ± 3.4 (Gráfico 5).

Todos los tratamientos son estadísticamente diferentes, siendo el tratamiento cuatro (T4) el más eficiente; este resultado se relaciona con la necesidad de fósforo como requerimiento esencial en los organismos fotosintéticos para la producción de ATP.

A diferencia del efecto de reducción observado con la DBO₅, el nivel de nitrógeno y los fosfatos, en donde T4 resultó ser el tratamiento más eficiente, en el caso de los sulfatos fue T3 el tratamiento que generó la mayor tasa de disminución con 58.9% ± 7.7; seguido por T4, con 47.8% ± 8.7; a continuación T6, con 33.3% ± 7.1; y, finalmente T5, con 14.9% ± 6.6 (Gráfico 5). La mayor reducción de sulfatos en cultivos sin aireación estaría relacionada con la capacidad de ciertas especies de Chlorophyta de crecer a bajas concentraciones de CO₂ como organismos mixotróficos, utilizando compuestos orgánicos e inorgánicos como aceptores de electrones en el proceso de respiración, entre ellos los sulfatos ^{(25, 26, 27)}.

Microalgas Chlorophyta identificadas morfológicamente.

Las algas presentes en los distintos tratamientos, que fueron analizadas mediante microscopía y mostraron características propias de las Chlorophyta, se describen en la Figura 2 ²⁸.

Figura 2 Microalgas Chlorophyta identificadas morfológicamente.