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1 Introducción
Lupinus mutabilis Sweet (chocho) es un cultivo con pocas exigencias nutricionales y se desarrolla en suelos marginales. Sus granos tienen un elevado valor nutritivo aportando proteínas muy valiosas en la dieta humana. Además, esta leguminosa preserva la fertilidad del suelo a través de la fijación de nitrógeno, es rica en calcio y proteínas, y su cultivo se ha extendido por todo el Ecuador, convirtiéndose en la protagonista de proyectos de desarrollo en zonas indígenas del país (, ).
Se considera que el grano de L. mutabilis Sweet posee un alto valor nutricional; de igual forma, las proteínas y aceites componen más de la mitad de su peso en promedio y a partir de los análisis bromatológicos posee 35,5 % de proteína, 16,9 % de aceites, 7,65 % de fibra cruda, 4,15 % de cenizas y 35,77 % de carbohidratos (, ). Además posee algunas proteínas que tienen la particularidad de reducir los niveles de glucosa en sangre (, ; , ).
Por ser un cultivo de ciclo corto y luego de cosechado el grano de L. mutabilis Sweet queda un residuo constituido por el follaje y las vainas que pueden llegar a representar el 75 % del peso de la planta. Este residuo suele ser incorporado nuevamente al suelo para que por degradación natural sus nutrientes regresen al suelo; por otro lado, este desecho puede también ser utilizado como fuente de alimentación para el ganado. Este residuo generalmente posee un contenido elevado de fibra que está constituido por fibra bruta (FB), fibra neutro detergente (FND) y fibra ácido detergente (FAD).
La fibra puede definirse como el conjunto de componentes de los vegetales que posee baja digestibilidad y promueve el equilibrio ruminal, debido a esto su uso ha estado principalmente dirigido hacia los rumiantes; no obstante, es posible incluirlo en dietas de ganado monogástrico ( , ). Sin embargo, su uso requiere una estrategia apropiada de transformación, para lograr sistemas de producción socialmente deseables y económicamente viables (, ; , ; , ) debido a la cantidad de compuestos anti-nutricionales (fibra, contenido fenólico, flavonoides, taninos) que se encuentran presentes en este tipo de harinas (, ; , ; , ). En el caso de la FND se recomienda que su contenido no exceda del 65 % y la FAD no sea mayor que 45 % ( , ), sin embargo, aunque los polifenoles cuentan con efectos beneficiosos para la salud animal, un contenido elevado de estos afecta el valor nutricional del sustrato (, ; , ).
La fermentación en estado sólido (FES) es un método de transformación que consiste en el crecimiento de microorganismos sobre un sustrato y bajo ciertas condiciones de humedad, pH, temperatura, facilita su crecimiento, desarrollo y reproducción (, ). En el caso de estudio, los microorganismos utilizados aprovechan los compuestos antinutricionales (FAD, FND, Polifenoles) como fuente de alimento para su crecimiento, logrando así su reducción. El uso de las FES ha demostrado el incremento del valor nutricional de los sustratos fermentados, así como la inocuidad de estos para su uso en la alimentación animal.
() incrementaron el valor nutritivo de la harina de cuatro leguminosas usando fermentación sólida con T. viride M5-2 para su uso en especies monogástricas. () publicaron una revisión en donde demostraban que el uso de sustratos que han sido enriquecidos por un proceso de fermentación sólida puede aumentar la concentración de ácidos grasos poliinsaturados en el rumen. En 2019, Sugiharto y Ranjitkar demostraron que la fermentación además de ser un medio económico para incrementar el valor nutricional de los ingredientes usados en los piensos de pollos de engorde también ejerce una influencia beneficiosa sobre el ecosistema y la morfología del intestino, las funciones inmunitarias y el rendimiento de crecimiento de las aves (, ; , ; , ).
Como objetivo de esta investigación se pretende mejorar el valor nutritivo de la harina de follaje de L. mutabilis Sweet mediante la fermentación sólida con las cepas Aspergillus niger J1 y Trichoderma viride M5-2.
2 Materiales y Métodos
2.1 Diseño experimental y análisis estadístico
Se usó un diseño completamente aleatorizado, con tres repeticiones y dos inóculos (A. niger J1 y T. viride M5-2), con 8 horarios de muestreo (0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h). Cada biodigestor fue considerado como una unidad experimental. Para los análisis estadísticos se usó el programa STATGRAPHICS XV CENTURION.
2.2 Microorganismos
Se utilizaron dos cepas de hongos con características lignocelulolíticas, Aspergillus niger J1 aislado a partir del bagazo de caña en la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Tecnológica de La Habana “José Antonio Echeverría”, CUJAE, y Trichoderma viride M5-2 que pertenece al banco de cepas del Instituto de Ciencia Animal (Mayabeque - Cuba). Se conoce que estas cepas poseen actividad hidrolítica y secretan enzimas celulasas en sustratos con elevada cantidad de fibra. Ambas cepas fueron evaluadas por medio de una fermentación en estado sólido (, ).
2.3 Sustrato para la fermentación
El sustrato vegetal consistió en plantas de L. mutabilis Sweet post cosecha (hojas y tallo), de la hacienda “Lupita” del cantón Riobamba de la provincia de Chimborazo. En el Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador (CIBE) se procedió a secarlo en una estufa HAFO SERIES 1 600 a temperatura de 65 ◦C por 48 horas y, posteriormente, se procedió a su molienda con un molino manual marca CORONA
2.4 Proceso de fermentación
Para la realización del presente trabajo se usaron 42 frascos de vidrio de 250 ml como biodigestores (21 para la fermentación con A. niger J1 y 21 para la fermentación con T. viride M5-2). Se agregó a cada uno 10 g del sustrato seco, posteriormente se humedeció con agua destilada hasta alcanzar una humedad inicial de 70 % (25 ml) y se enriqueció con urea 2,5 % (0,25 gr), fosfato de potasio (KH2PO4) 5 % (0,5 gr) y sulfato de amonio ((NH4)2SO4) 10 % (1 gr) (, ) y se reguló el pH inicial del sustrato en 6. El sustrato húmedo se esterilizó con vapor saturado en autoclave por 20 min a 121 C. Para la inoculación del sustrato se prepararon dos suspensiones de esporas, la suspensión de A. niger J1 se inoculó en los biodigestores que contenían el sustrato a fermentarse, con una concentración de 106 esporas/g de sustrato seco ( , ) y la suspensión de T. viride M5-2 se inoculó en los restantes biodigestores con una concentración de 107 esporas/g de sustrato seco (, ).
Los frascos inoculados y homogenizados se colocaron en incubación a 30 ◦C durante 168 h. Se tomaron muestras cada 24 h para realizar los análisis correspondientes y se determinó el crecimiento de los hongos y la colonización del sustrato por observación visual.
2.5 Análisis químicos y enzimáticos
Se pesaron 3 g del material fermentado a las 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h, se añadieron 30 ml de agua destilada, y se colocaron en un agitador mecánico a 140 rpm por 20 min. Posteriormente, se centrifugó la muestra a 5 000 rpm por 10 min y se filtró en papel filtro Whatman número 40 para obtener el extracto enzimático. Se midió el pH y se realizó el análisis enzimático de la actividad exo 1,4 β-D glucanasa (PFasa) utilizando la técnica de la National Renewable Energy Laboratory NREL/TP-510-42628 de enero de 2008 ( , ). Esta actividad enzimática se expresó en unidades de papel filtro por mililitro (UPF/ml).
Los indicadores bromatológicos que se estudiaron fueron la conversión de materia seca (MS) calculada por gravimetría por la diferencia entre la masa seca inicial y la masa seca final (, ), Fibra Neutro Detergente (FND) y Fibra Acido Detergente (FAD), lignina (LIG) por el método ANSI/ASTM D1106-56 y celulosa (CEL) por el método ANSI/ASTM D1103-60 1977. También se analizó el contenido de compuestos fenólicos (mg de ac. gálico/100 g de sustrato seco) de acuerdo al método de folin ciocalteu (, ) y el contenido de flavonoides por el método espectofotométrico (mg de catequinas / 100 g de sustrato seco) (, ).
3. Resultados y Discusión
La composición bromatológica y la granulometría del sustrato se detallan en las Tablas 1 y 2, respectivamente. La fibra, particularmente la que proviene de los forrajes constituye el componente principal de la alimentación de los rumiantes, y su uso en monogástricos se ven limitados debido a la morfología de su sistema digestivo y a pesar de eso varias investigaciones demuestran la factibilidad del uso de este tipo de sustratos en su alimentación ( , ; , ).
Los componentes fenólicos, particularmente los taninos, tienen la particularidad de precipitar ciertas proteínas disminuyendo así su digestibilidad y reduciendo la disponibilidad de aminoácidos, comprometiendo el valor nutritivo del sustrato ( , ).
En la Tabla 3 se observa que ambas cepas mostraron crecimiento en el sustrato elegido, pero las diferencias entre ambas se observaron a nivel de esporulación. Por un lado, la cepa A. niger J1 mostró un crecimiento micelial a las 24 horas, empezó la esporulación a las 48 h y en 72 h ya había colonizado completamente la superficie del sustrato; por el otro, la cepa T. viride M5-2 empezó a las 72 h y no llegó a cubrir de esporas el sustrato durante todo el experimento. Un factor importante en el resultado observado del crecimiento micelial podría ser el tamaño de partícula, pues como mencionan () y (), la colonización del sustrato y la esporulación se favorecen con la superficie de contacto, es decir, mientras mayor sea esta, mejor será la colonización.
En la Figura 1 se observa la variación del pH durante las 168 h de fermentación. Para ambas cepas se observan valores de pH entre 6 y 8, esto se corresponde con el intervalo de acción de las enzimas celulolíticas en sustratos fibrosos. Se conoce que los valores óptimos de pH iniciales para la acción hidrolítica de las enzimas celulasas se encuentran entre 5 y 6, aunque estos pueden variar en función del sustrato a fermentar, la temperatura de incubación e incluso con la cepa origen de la enzima (, ).
En esta investigación la cepa de T. viride M5-2 mostró baja acción celulolítica entre los pH 6 y 8 durante la fermentación de L. mutabilis Sweet a 30 C, a diferencia de lo que se obtuvo en otros trabajos con leguminosas (Vigna unguiculata) en donde el pH se mantuvo en valores entre 5 y 7 (, ) (Figura 2). Se observó también que durante la fermentación con la cepa de T. viride M5-2 el pH se elevó hasta niveles por encima de 8 después del tercer día de fermentación. Esto podría estar relacionado con los grupos α amino presentes en las proteínas del sustrato, que al disolverse en agua se ionizan y se elimina un protón del grupo funcional que pudiera elevar el pH, y también que el sustrato es rico en compuestos nitrogenados que podrían contribuir con el incremento del pH (, ).
En la Tabla 4 se observa el proceso de fermentación de L. mutabilis Sweet en relación con la conversión de materia seca (MS), y también que existe interacción entre los factores estudiados. La cepa de A. niger J1 convierte hasta 7,68 unidades porcentuales en las 168 h de fermentación. Por otro lado, la cepa de T. viride M5-2 solo 1,3 unidades porcentuales en el mismo tiempo. Estos valores son un indicativo de la actividad de la fermentación, observándose una conversión del sustrato por parte de los hongos. La diferencia de la conversión entre las cepas puede deberse al mismo metabolismo de los hongos ( , ) así como a la composición de los carbohidratos solubles y, por consiguiente, al carácter de alimento funcional de las leguminosas ( , ).
Tabla 3 Crecimiento de las cepas A. niger J1 y T. viride M5-2 durante la dinámica de fermentación de L. mutabilis Sweet a Temperatura = 30◦C, pH=6, Humedad=70 %
Figura 1 Variación del pH en la dinámica de fermentación del L. mutabilis Sweet por las cepas A. niger J1 y T. viride M5-2 EE (±) 0,168 P<0,001
Las determinaciones de la actividad exo β 1,4glucanasa (Figura 2) mostraron que los hongos producen enzima celulasa y la actividad de estas enzimas se alcanza en su mayoría durante las primeras horas de fermentación y mantienen actividad durante las 168 h de fermentación. Esta actividad hidrolítica presenta una marcada diferencia. La cepa de A. niger J1 tiene mayor actividad celulolítica e incrementa durante la fermentación de L. mutabilis Sweet desde 0,064 UPF/mL hasta 0,189 UPF/mL al finalizar la fermentación y se corresponde con la colonización del hongo en el sustrato y su esporulación. Sin embargo, en el caso de la cepa de T. viride M5-2 no se aprecia un aumento notable de la actividad enzimática, alcanzando los valores máximos de 0,106 UPF/mL en el segundo día de fermentación y posteriormente la actividad se redujo a valores de hasta 0,074 UPF/mL; estos valores de actividad enzimática fueron muy bajos. Este comportamiento pudiera estar relacionado con el tipo de sustrato que no favoreció la acción hidrolítica ( , ), y a su vez podrían estar relacionados con el pH elevado que afecta la actividad enzimática (, ).
Figura 2 Actividad enzimática exo β 1-4 glucanasa de las cepas A. niger J1 y T. viride M5-2 durante la dinámica de fermentación en estado sólido de L. mutabilis Sweet. EE (±) 0,038 P<0,001
Tabla 4 Conversión de materia seca durante el proceso de fermentación sólida de L. mutabilis Sweet con A. niger J1 y T. viride M5-2. Condiciones iniciales: Temperatura=30 ◦C, pH=6, Humedad=70 %
En la Tabla 5 se observa el efecto del proceso fermentativo en la fracción fibrosa del sustrato. Se observa una reducción notable de los valores de FND por ambas cepas y de FAD por la cepa A. niger J1. Dicha reducción puede estar relacionada con los altos valores de nitrógeno asociado a este indicador (, ) ya que las cepas estudiadas, además de usar los componentes de la pared celular, pudieron metabolizar parte del nitrógeno asociado a la fibra como nutriente, antes de comenzar a degradar la lignina (, ).
La FND o también llamada fibra insoluble es la que mejor predice el valor energético del sustrato. Los niveles muy bajos ralentizan el tránsito intestinal, reducen los rendimientos productivos e incrementan el riesgo de padecer patologías digestivas (, ), pero un exceso de este valor también está relacionado con la poca digestibilidad del sustrato, especialmente en especies monogástricas que no tienen el sistema digestivo adaptado al consumo de piensos con niveles de fibra altos. () demostró que la cepa de T. viride M5-2 tenía un potencial valioso para la biotransformación de sustratos fibrosos que pudieran ser incluidos posteriormente en la alimentación animal.
Ambas cepas mostraron capacidad de degradación de la fracción fibrosa del sustrato. A. niger J1 redujo la FND y la FAD en 12 unidades porcentuales, mientras que T. viride M5-2 redujo la FND en 12 unidades porcentuales, pero la FAD solo en 6 unidades. La actividad celulolítica es mayor en A. niger J1 pudiendo degradar la celulosa 11 unidades porcentuales, mientras que T. viride M5-2 solo 4 unidades.
El uso de L. mutabilis Sweet como sustrato para las fermentaciones sólidas ha sido poco estudiado.
Por el contrario, se han usado otras variedades de Lupinus en fermentaciones con bacterias para incrementar sus valores nutricionales (, ; , ).
La Tabla 6 muestra el efecto que produce la fermentación sobre los metabolitos secundarios presentes y asociados a la fracción fibrosa del sustrato analizado. Del análisis del contenido fenólico y su transformación se observó que la cepa de A. niger J1 redujo de 9,78 mg hasta 1,83 mg por cada 100 gramos de sustrato seco, alcanzando la mayor reducción durante los tres primeros días. Esta reducción está acorde con lo publicado por () que reduce hasta un 75 % el contenido de polifenoles utilizando otra cepa de A. niger.
Por otro lado, T. viride M5-2 solo redujo el contenido fenólico de 9,78 mg hasta 4,49 mg a lo largo del proceso. La cepa A. niger J1 reduce los flavonoides en un 53 % con relación al sustrato sin fermentar, mientras que la cepa de T. viride M5-2 los reduce en un 22 % durante los cuatro primeros días de la fermentación; sin embargo, a partir del quinto día estos se concentran probablemente por la reducción de la materia seca durante la fermentación.
A diferencia de otros sustratos lignocelulósicos, para la fermentación del Lupino no se requirió un pretratamiento. Esto ya se había observado en experimentos realizados a nivel de laboratorio con otro tipo de leguminosas (, ), pero no cuando se usa el bagazo de caña (, ).
Se observaron resultados similares en estudios fitoquímicos de los compuestos fenólicos realizados por () en forraje de otras leguminosas con varias cepas de hongos. Sin embargo, el potencial enzimático la cepa T viride M5-2 en esta leguminosa temporal tuvo mayor impacto en su transformación, con una reducción 32 % de los polifenoles, 18 % de los flavonoides y un 3 % de fibra, sin adición de otras fuentes minerales.
Tabla 5 Efecto del proceso de fermentación en la fracción fibrosa del sustrato con ambas cepas. Temperatura=30 ◦C, pH=6, Humedad=70 %
4 Conclusiones
Los resultados demuestran que al utilizar una fermentación en estado sólido es posible reducir factores antinutricionales de una harina de follaje de L. mutabilis Sweet hasta obtener valores aceptables, lo que incrementa su potencial valor nutricional. En el presente estudio se redujeron considerablemente los valores de FND, FAD, flavonoides y contenido polifenólico durante la fermentación, lo que incrementa su calidad nutritiva, mejorando sus potencialidades para el uso en especies monogástricas, y favoreciendo su posterior procesamiento.
Las cepas T. viride M5-2 y A. niger J1 permitieron desarrollar un proceso fermentativo biológicamente factible con la harina de follaje en estudio, mejorando su valor nutritivo, obteniéndose los mejores resultados con la cepa de A. niger J1. Se recomienda optimizar el proceso para su escalado.
