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Araujo-Abad, L.S., Tapia, W. y Villamarín-Ortiz, A. (2020). Verificación del método analítico de espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito para la cuantificación de cadmio en almendra de cacao (Theobroma cacao). La Granja: Revista de Ciencias de la Vida. Vol. 31(1):56-70. http://doi.org/10.17163/lgr.n31.2020.04.
1. Introducción
Los granos de cacao son las semillas del árbol de Theobroma cacao (nativo de la Región amazónica de América del Sur), que se consumen ampliamente en todo el mundo (Almeida y Valle, 2007). Es un cultivo neotropical, perenne importante que crece a 20° norte y 20° sur de la línea ecuatorial aproximadamente (Shavez Beg et al., 2017). Se cultiva a una altura de menos de 400 msnm; el rango óptimo de temperaturas oscila entre 22 °C y 30 °C, dependiendo de la variedad (Damatta et al., 2018), y la lluvia debe ser de al menos 1500 a 2500 mm de agua al año.
Las almendras son de color marrón y están cubiertas en el exterior por un mucílago blanco y dulce que es comestible (Waizel-Haiat et al., 2012), que se procesan para obtener licor de chocolate, cacao en polvo y manteca de cacao que son los principales ingredientes del chocolate y una amplia gama de productos como bebidas de cacao, helados, productos de panadería que otorgan un sabor característico y distintivo a sus productos derivados (Dasgupta et al., 2014). Los granos de cacao son la materia prima para la industria multimillonaria que produce chocolate y productos de confitería. La importancia económica de la industria del chocolate en el mercado mundial se ha revisado recientemente (Squicciarini y Swinnen, 2016) subiendo un 13% desde 2010 hasta alcanzar los US $ 101 mil millones en 2015, con Suiza como el país con el índice de consumo más alto (Wickramasuriya y Dunwell, 2018).
Ecuador, por sus condiciones geográficas y su riqueza en recursos biológicos, es el productor por excelencia de cacao fino de aroma (63% de la producción mundial) proveniente de la variedad nacional, cuyo sabor ha sido reconocido durante siglos en el mercado internacional. Este tipo de grano es utilizado en todos los chocolates refinados. Del total de la exportación ecuatoriana se estima que, un 75% es cacao fino de aroma, mientras que el restante 25% pertenece a otras variedades como el CCN51. Ecuador se posiciona como el país más competitivo de América Latina en este campo, seguido por Venezuela, Panamá y México, que son países que poco a poco han incrementado su participación en el mercado mundial (Anecacao, 2019).
Varios atributos de la calidad del grano, tanto físicos como químicos, son requeridos por los fabricantes, compradores de cacao y, organismos de control para alentar a la comunidad del cacao hacia una producción de mejor calidad (CAOBISCO/ECA/FCC, 2015). Estas características de calidad incluyen el sabor, pureza y salubridad (p. ej., libre de bacterias, infestación, alérgenos, micotoxinas, metales pesados y residuos de plaguicidas), características físicas (p. ej., consistencia, rendimiento de material comestible del grano, tamaño y uniformidad, contenido de cáscara, contenido de grasa y contenido de humedad) y las características de la manteca de cacao (p. ej., libre de ácidos grasos) (Dasgupta et al., 2014). Algunos de los atributos de la calidad de grano como el contenido total de grasa, acidez, fenoles totales, ácidos orgánicos, metales pesados, aminoácidos, cafeína, teobromina, pH, azúcares, contenido de macro y micronutrientes, han sido considerados en la propuesta de índice de calidad del cacao (CQI) para algunos tipos de grano (Araujo et al., 2014).
Los metales pesados se definen como elementos con una densidad superior a 5 g/cm3 (Navarro-Aviñó, Aguilar Alonso y López-Moya, 2007). El cobre, hierro, magnesio y cinc en bajas concentraciones son esenciales para los procesos bioquímicos y fisiológicos en las plantas, mientras que arsénico, cadmio y plomo no tienen un papel conocido en ellas (Ali, Khan y Anwar Sajad, 2013). La acumulación de metales pesados en las plantas se ve afectada por varios factores como el pH, el contenido de materia orgánica y la textura del suelo, el genotipo de la planta y el contenido de metales pesados en el medio de crecimiento. América Latina posee los niveles más altos de metales pesados en los granos de cacao, especialmente de cadmio y plomo (Bertoldi et al., 2016), en comparación con otros productores en el mundo. La presencia de metales pesados en los granos de cacao representa una amenaza para los productores de cacao, ya que un alto contenido de metales pesados podría afectar la exportación de los granos.
Al chocolate se le ha atribuido el logro de una salud y desarrollo de seres humanos óptimos, debido a su alto contenido de flavonoides que son cruciales para reducir el riesgo o a su vez retrasar el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, cáncer y otras relacionadas con la edad (Cooper et al., 2008).
En 2014, la Unión Europea anunció, mediante el Reglamento (UE) No 488/2014, planes para implementar regulaciones acerca de los productos de chocolate y cacao que contienen niveles excesivos de cadmio (Cd), que entraron en vigor el 1 de enero de 2019 (Comission Regulation EU, 2014). El incumplimiento de las regulaciones tendría importantes consecuencias económicas y sociales para los países productores de cacao, como el Ecuador, a partir de la fecha de entrada en vigor de dicho reglamento. El Cd ha recibido atención en la última década debido a su importancia en la calidad/seguridad de los alimentos, y en la salud humana, ya que el consumo de alimentos con alto contenido de este metal pesado podría conducir a disfunción tubular renal, formación de cálculos renales, alteración del metabolismo del calcio y defectos esqueléticos, endocrinos, reproductivos y respiratorios (Järup y Akesson, 2009).
Las técnicas analíticas para la determinación de Cd se basan en el uso de reactivos que actúan sobre la digestión del grano y que son altamente peligrosas. Uno de los reactivos de uso frecuente es el Agua Regia (HCl:HNO3), que se somete a calor dando como resultado vapores irritantes y corrosivos; el protocolo utilizado corresponde a una adaptación del método oficial AOAC: 999.11 (AOAC, 2005).
Por ser un método analítico más eficaz y menos tóxico para el ser humano y el ambiente, en el presente trabajo se verificó el desempeño del método de espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito (GFAAS) en la determinación de Cd en almendra de cacao (Theobroma cacao), mediante la determinación de linealidad, precisión y veracidad (Eurolab España y Morillas, 2016) e incertidumbre (IRAM 35050, 2001) sobre material de referencia certificado, y se validó el protocolo analítico para la determinación de la concentración de Cd en muestras de almendra de cacao; adicionalmente, se realizó una prueba de comparación inter laboratorios.
2. Materiales y Métodos
Primera fase: se realizó la verificación del método analítico evaluando los parámetros de linealidad, precisión, veracidad e incertidumbre, a partir de material certificado MRC 07206B y 07167A.
Segunda fase: se recolectaron las muestras de cacao (mazorcas) por personal designado de AGROCALIDAD, en cuatro fincas de la zona cacaotera del país: Flavio Alfaro–Manabí, Ecuador, denominadas como A, B, C, D. Posteriormente, en los laboratorios de Bromatología y Microbiología de AGROCALIDAD se analizaron las muestras correspondientes para determinar su contenido en Cd, previa verificación de estado de calibración de los instrumentos y materiales volumétricos a utilizar.
Tercera fase: se elaboró el protocolo PEE/B/14 para la determinación de Cd en la almendra de cacao por GFAAS, que contiene el proceso de preparación de las muestras (mazorca de cacao) desde su recepción, secado, homogenización, digestión por microondas y posterior lectura en el espectrómetro con horno de grafito.
2.1 Verificación del método analítico
Para la verificación del método analítico se tomó como referencia a la Guía Eurachem de Eurolab España (2016), y al estándar IRAM 35050 (2001), siguiendo el protocolo PEE/B/14.
2.1.1 Linealidad
Se elaboró una curva con 10 concentraciones a partir del estándar de Cd de 20 ppb. Las concentraciones utilizadas fueron de 0 a 18 ppb. En la curva se expresó en el eje de las “x” la concentración teórica en µg/L y en el eje de las “y” la concentración calculada en µg/L. A partir de la curva resultante se escogió el rango lineal y se elaboró una nueva curva. En este intervalo lineal se midió por triplicado un blanco, seis diluciones diferentes del estándar de 20 ppb y finalmente los MRC 07206B y 07167A.
2.1.2 Precisión
Se realizaron quince lecturas de cada MRC 07206B y 07167A y se calculó la desviación estándar (s) de cada material, usando la siguiente fórmula:
Desviación estándar (s)
Donde:
n = número de mediciones totales del material de referencia.
= promedio de las lecturas.
x = cada medición realizada.
2.1.3 Veracidad
Se realizaron diez lecturas para MRC 07206B, diez lecturas para tres blancos digestados y diez lecturas para tres blancos adicionados con 2, 3 y 4 ppb de Cd. Además; también se realizaron diez lecturas sobre tres muestras analizadas, en primera instancia, por el método que normalmente usaba el laboratorio, en el que se emplea una digestión ácida con Agua Regia (HCl:HNO3), seguida de una lectura mediante espectroscopía de absorción atómica (AA) de llama y, en segunda instancia, por el método GFAAS verificado y el protocolo de análisis propuesto en esta investigación.
Con los datos obtenidos para el MRC 07206B se procedió a realizar los cálculos con las siguientes fórmulas proporcionadas por Eurolab España y Morillas (2016):
Recuperación relativa
Donde:
= media de las lecturas del MRC 07206B.
= valor teórico que el certificado otorga al material de referencia.
Con los valores calculados se obtuvo una medida del sesgo tomando en cuenta los efectos del laboratorio comparado con los datos del sesgo del método.
Para el análisis de los datos obtenidos de las mediciones de blancos digestados y blancos adicionados, se usó la siguiente fórmula Eurolab España y Morillas (2016):
Recuperación relativa de adiciones
Donde:
= valor medio de los blancos adicionados.
= valor medio de los blancos digestados.
= valor de concentración añadida.
Finalmente, con los datos obtenidos de la lectura de muestras por el método normalmente usado en el laboratorio, el método GFAAS verificado y el protocolo de análisis propuesto, se realizaron los cálculos en base a las siguientes ecuaciones Eurolab España y Morillas (2016):
Recuperación relativa
Donde:
= media de las lecturas de las muestras por el método antiguo.
= media de las lecturas de las muestras por el método nuevo propuesto.
Con los valores calculados se obtuvo la medida del sesgo, en función al método GFAAS verificado y el protocolo de análisis propuesto, para así demostrar su eficacia y sustituir al método normalmente utilizado por AGROCALIDAD.
2.1.4 Incertidumbre
Se realizaron 10 lecturas de la concentración del material de referencia y se calcularon los valores de incertidumbre con las siguientes fórmulas (IRAM 35050, 2001):
Promedio (I) de las lecturas
Donde:
n = número de mediciones del material de referencia.
= cada medición de material de referencia.
Desviación estándar (I k )
Donde:
n = número de mediciones totales del material de referencia.
= promedio de las lecturas.
= cada medición realizada.
Incertidumbre estándar S(I)
Donde:
S (
)= la desviación estándar.
n = número de mediciones totales del material de referencia.
2.2 Determinación de cadmio en almendra de cacao
Con las muestras obtenidas de las Fincas A, B, C y D se procedió de acuerdo al protocolo elaborado (Procedimiento PEE/B/14) a la determinación de Cd en almendras de cacao en el que se detalla:
Procesamiento de la muestra: Se secaron las almendras de cacao en la estufa a una temperatura de 150 °C, por un período de 24 horas y se verificó que la cáscara se desprendía con facilidad, de lo contrario se continuó el secado por 12 o 24 horas adicionales y se realizó una nueva verificación antes de sacar el cacao de la estufa. El descascarillado se realizó en forma manual con las muestras calientes para que su desprendimiento se realizara con mayor facilidad. Para descascarillar el grano, se presionó con las yemas de los dedos o golpeando suavemente con un pistilo de mortero. Se procesaron aproximadamente 20 g de muestra en el molino, hasta obtener un producto homogéneo. Se guardó la muestra procesada en frascos de polipropileno con el código de la muestra.
Digestión: Se pesó con precisión 0.5 g de muestra seca en el envase de digestión y se sometió a digestión por microondas según a los parámetros indicados por el equipo.
Preparación de estándares: Se preparó 20 ml de solución madre de Cd de 1000 ppb. Se tomó 2 ml de estándar de Cd de 1000 µg/ml con pipeta volumétrica y se aforó a 20 ml con ácido nítrico al 1%. A partir de esta solución, el equipo de absorción atómica por horno de grafito realizó de forma automática las diluciones correspondientes (1-5 ppb).
Lectura de las muestras: Se midió la concentración de cada muestra codificada en el equipo, que fue programado para realizar lecturas por triplicado sobre una misma muestra y el resultado se expresó en partes por billón (ppb).
2.3 Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó tomando en cuenta cada parámetro de verificación del método: linealidad, precisión, veracidad e incertidumbre, cada uno de los cuales proporciona fórmulas para el cálculo de medias, sesgo, sesgo relativo y recuperación. Además, en la determinación de Cd en almendras de cacao se realizó un análisis de varianza para determinar si existen diferencias significativas entre las muestras obtenidas en cada finca. Se utilizó el programa estadístico Graphpad Prism 7.
3. Resultados
3.1 Verificación del método analítico
3.1.1 Linealidad
En la Figura 1, se graficó la concentración teórica(0-18 ppb) frente a la proporcionada por el equipo(calculada) y, se procedió a realizar un análisis visualen el que se estableció que el rango lineal seencuentra entre 0 y 8 ppb (Figura 2 y 3). Se observaque el rango lineal se encuentra entre 0 y 8 ppb (Figura 2), con un coeficiente de residualidad de0,9956, aceptable para procedimientos analíticos.
El método GFAAS arrojó una curva de calibración (Figura 3), que presentó un coeficiente de residualidad de 0.998770, mucho más exacta que la calculada, en razón que esta utiliza sólo los puntos de interés, eliminado errores de fondo. Para confirmar la linealidad del método y siguiendo el procedimiento de la Guía Eurachem (2016) se midió un blanco y seis disoluciones de concentraciones conocidas en el rango lineal dado por el equipo, que está representado en la Figura 4. En la Figura 4A. se observa que el coeficiente de residualidad fue de 0.9964; Figura 4B. 0.9976 y Figura 4C. 0.9952, que confirman la linealidad del método.
3.1.2 Precisión
Se midió la precisión del analista, equipo y método analítico, mediante 15 lecturas de dos materiales de referencia certificados 07206B y 07167A, obteniéndose una desviación estándar mínima y menor a la dada por el fabricante del equipo que fue 0.02 como se observa en la Tabla 1.
3.1.3 Veracidad
En la medición de la veracidad se realizaron diez lecturas del material de referencia certificado 07167A; en base a los datos obtenidos se calculó la media, el sesgo, sesgo relativo en porcentaje y la recuperación relativa, usando como valor referencial el dato proporcionado por el certificado del material de referencia, como se observa en la Tabla 2.
Tabla 2. Concentración de cadmio obtenida de 10 lecturas del material de referencia certificado de cacao en polvo
Adicionalmente se realizaron diez lecturas de tres blancos y diez lecturas de los mismos blancos adicionados con 2, 3 y 4 ppb de Cd, con lo que se obtuvo la media y porcentaje de recuperación, como se observa en la Tabla 3.
Finalmente se realizaron diez lecturas de tres muestras por el método normalmente usado por el laboratorio (AA), por el método GFAAS verificado y el protocolo propuesto, como se observa en la Tabla 4.
En la Tabla 4 se puede observar que el sesgo en la lectura de las tres muestras por los dos métodos es mínimo y el porcentaje de recuperación es elevado, lo que da confiabilidad al método GFAAS.
3.1.4 Incertidumbre
Se midió diez veces la concentración de Cd de dos materiales de referencia 07206B y 07167A, y se calculó la media, desviación estándar e incertidumbre estándar (Tabla 5).
La incertidumbre calculada midiendo la concentración de Cd de los MRC (07206B y 07167A) es de 0,00013 y 0,00082, respectivamente (Tabla 5), lo que indica que las mediciones realizadas no estuvieron afectadas por errores sistemáticos en el proceso.
3.2 Determinación de cadmio en almendras de cacao
Se analizaron muestras provenientes de cuatro fincas de Flavio Alfaro- Manabí nombradas A, B, C y D (Tabla 6), colectándose 15 muestras de la finca A, 9 muestras de la finca B, 4 de la finca C y 5 de la finca D, de acuerdo a protocolos internos de Agrocalidad, estableciendo las siguientes hipótesis:
Hipótesis nula: la concentración de Cd en las almendras de cacao de las cuatro fincas no es significativamente diferente.
Hipótesis alternativa: la concentración de Cd en las almendras de cacao de al menos una finca difiere significativamente de las demás.
Después de realizar el análisis de varianza (Tabla 7) al ser p<0,05 se acepta la hipótesis alternativa, es decir, la concentración de Cd en las almendras de cacao de al menos una finca difiere de las demás.
La Finca A que tiene como promedio 0,546 mg/Kg siendo el valor más alto respecto a las demás fincas, cabe mencionar que entre la Finca B y D no existen diferencias significativas ya que en las dos fincas la concentración de Cd en la almendra de cacao fue de 0,260 mg/Kg. La Finca C presenta la concentración más baja de Cd en la almendra de cacao siendo de 0,146 mg/Kg.
4. Discusión
La verificación del método analítico de espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito en el Laboratorio de Bromatología y Microbiología de Agrocalidad, cumplió con los parámetros de desempeño: linealidad, precisión, veracidad de acuerdo a la Guía Eurachem (Eurolab España. P.P. Morillas et al., 2016) e incertidumbre de acuerdo con la Guía para el Cálculo de Incertidumbre del Instituto Argentino de Normalización y Certificación IRAM 35050 (2001). La linealidad se trabajó con una curva en un rango de 0 a 8 ppb, cuyo R2= 0,998770, que por su cercanía a +1 indica que existe una “perfecta” correlación entre las variables, siendo aceptable para mediciones analíticas (Gaddis y Gaddis, 1990). La precisión para dos materiales de referencia certificados (07206B y 07167A) arrojaron una desviación estándar de 0,0005 y 0,0022, respectivamente, lo cual implica que las mediciones realizadas por el analista fueron precisas y repetibles. En cuanto a la veracidad, se comprobó que la metodología propuesta arroja resultados similares a la metodología no estandarizada y tóxica que el Laboratorio de Bromatología y Microbiología de Agrocalidad empleaba para los análisis de Cd, puesto que el sesgo entre las dos metodologías fue mínimo y el porcentaje de recuperación fue mayor a 100% por lo que cumple con lo mencionado por Ospina y Zapata (2012), quienes señalan que el porcentaje de recuperación en un método analítico debe ubicarse en un rango de 80% a 120%. Además, es comparable con la validación de (Lo Dico et al., 2018) en la que obtienen un porcentaje de recuperación de 110%. La incertidumbre estándar fue de 0,00013 y 0,00082, lo cual otorga confiabilidad al método propuesto y lleva a suponer que trabajar en un ambiente cerrado y con los demás equipos del laboratorio apagados conlleva a minimizar los errores tal como menciona (Gonzaga, 2016).
Una investigación relacionada es la de Acosta y Pozo (2013) en la que se aplicó el método oficial AOAC 999.11, donde no se evidencia la verificación de los parámetros de desempeño en el laboratorio de Agrocalidad, por lo que sus resultados no son confiables. Sin embargo, la misma autora recomienda usar para la digestión de la muestra un tipo de digestión por microondas, la cual es más rápida y eficaz, por lo que en la presente investigación se usó dicha metodología de digestión basada en la norma (AOAC, 2010), obteniéndose buenos resultados.
En investigaciones relacionadas se usa en su mayoría la técnica de espectroscopía acoplada a llama con una digestión perclórica como la de Mite, Carrillo y Durango (2010) y, una digestión nítrica previa seguida de la lectura por espectroscopia de emisión atómica acoplado a plasma (ICP-MS) de Chavez et al. (2015); sin embargo, se puede usar la ICP-MS después de una digestión por microondas, que otorga mayor especificidad del análisis (Lo Dico et al., 2018).
De acuerdo con lo estipulado por la Unión Europea (0,8 ppm de Cd en cacao en polvo), que entró en vigor en enero de 2019, el cacao de las cuatro fincas presentadas en este estudio podría ser exportado sin restricciones, habiendo estado sus niveles (0.546 A; 0.261 B; 0.146 C; 0.262 D) dentro del rango permitido. De igual forma cumplen con el lo indicado por el Comité del Codex sobre contaminantes en alimentos (CCCF), que, en la 9° sesión celebrada en los Países Bajos, estipula un límite de 1,5 ppm (CCCF, 2015).
De acuerdo a Chavez et al. (2015) la diferencia en el contenido de Cd en las cuatro fincas se puede atribuir a la existencia de contaminación por metales pesados en el agua de riego o contaminación del suelo (Rankin et al., 2005), por otra parte Acosta y Pozo (2013) hacen referencia a la ubicación de los cultivos, es decir, si se encuentran cerca de la carretera asfaltada, existe mayor probabilidad de acumular metales pesados tanto en el suelo como en las partes aéreas de las plantas por las emisiones de los vehículos circulantes a la atmósfera, lo que no ocurriría con las fincas que se encuentran alejadas de la carretera. En adición a lo mencionado, Mite, Carrillo y Durango (2010) acotan que la contaminación por Cd de las almendras de cacao puede darse además por la quema de residuos urbanos, el uso de lodos urbanos en la agricultura, agroquímicos y contaminación por derivados del petróleo al secar el cacao en carreteras. Por su parte, en una investigación reciente de Argüello et al. (2019) se hace referencia a que la concentración de Cd en la almendra de cacao puede variar de una finca a otra respecto al genotipo (CCN-51 vs. Nacional) cultivado.
A pesar de que este estudio no se centró en la determinación de Cd en almendras de caco sino en una validación del método analítico para cuantificar este metal, se ha logrado aportar significativamente al desarrollo de posteriores estudios en donde se use GFAAS y, se investigue la trazabilidad del Cd hasta llegar a las almendras, siendo evidente que el suelo es el mayor suministro de este metal, pudiéndose implementar estrategias de mitigación, como la biorremediación.
5. Conclusiones
Se verificaron con éxito los parámetros de desempeño del método analítico de espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito, con lo cual se aseguró que el método es confiable y puede ser usado en el Laboratorio de Bromatología y Microbiología de Agrocalidad. El protocolo (PEE/B/14) elaborado permite la aplicación correcta del método en el análisis de Cd en la almendra de cacao puesto que define un procedimiento operativo estándar que asegura el fiel cumplimiento de los requisitos de ensayo para obtener resultados confiables. Por otra parte, se evidenciaron diferencias en la concentración de Cd en la almendra de cacao de las fincas objeto de estudio que están relacionadas a la procedencia de las muestras. Sin embargo, todas las muestras analizadas revelaron concentraciones de Cd inferiores a lo estipulado por la Unión Europea (0,8 ppm de Cd en cacao en polvo) además, cumplen con lo indicado por el CCCF, un límite de 1,5 ppm, por lo que este cacao podría exportado sin restricciones.
La prueba inter-laboratorio que se llevó a cabo ratifica la validez del método verificado en esta investigación.
En vista de la diferencia en la concentración de Cd de acuerdo con la procedencia de las muestras, es recomendable realizar otras investigaciones referentes a los factores que intervienen en la contaminación de este elemento en el cacao.
