2.1 Ubicación fase de laboratorio

La fase experimental se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología de la Universidad Politécnica Salesiana del CIVABI que se encuentra ubicado en el Distrito Metropolitano de Quito de la provincia de Pichincha, Ecuador.

2.2 Muestreo del suelo

Con el objetivo de aislar cepas nativas de Trichoderma spp. se extrajeron muestras de suelo de la hacienda “La Alegría” ubicada en el cantón Pedro Moncayo. Con la ayuda de una barra y una pala limpias, a una profundidad de 10-20 cm, se procedió a tomar submuestras de suelo, las que fueron depositadas en un recipiente plástico limpio para formar así una muestra completa. A continuación se tomó 500 g de suelo, que fueron colocados en fundas plásticas y etiquetados debidamente para su respectivo procesamiento.

2.3 Aislamiento y purificación de cepas de Trichoderma

De cada muestra se tomó 5 g de suelo que fueron colocados en fundas estériles con 50 ml de solución de cloruro de sodio al 1%. Se agitaron las muestras manualmente por 15 minutos. De cada muestra se procedió a tomar 100 µl y se inoculó en cajas Petri con medio Agar Sabouraud Dextrosa. Las cajas fueron selladas con parafilme incubadas a 26^◦C durante 7 días o hasta el aparecimiento de las colonias de Trichoderma. Para la purificación las colonias identificadas como Trichoderma se realizó transferencia directa cajas Petri con medio PDA (^{Girard, 1964}).

2.4 Mantenimiento de cepas de Trichoderma

Para el mantenimiento de las cepas éstas fuerontransferidas a tubos con medio PDA. Los tubos fueron sellados con para film e incubados a 26^◦C durante 2 a 3 días o hasta observar el aparecimiento de micelio y esporas. Se añadió a los tubos aceite de vaselina, los mismos que fueron sellados con para filmy colocados en refrigeración (^{López, 2007}).

2.5 Identificación de microorganismos aislados

La identificación de aislados se realizó mediante reconocimiento de crecimiento de estructuras microscópicas (hifas, esporas y clamidosporas) y macroscópicas (color de micelio, forma de micelio y crecimiento). Las características macro y microscópicas fueron cotejadas con las claves de identificación de géneros de Deuteromycetes (^{Gams, 1998}), para especies de Trichoderma (^{Girard, 1964}) y la clave interactiva de la APS (Samuels, 2006).

2.6 Multiplicación masiva de Trichoderma

Se colocaron 50 g de sustrato (arroz) cocido en recipientesde vidrio, se sellaron y se colocaron en la autoclave durante 10 minutos a 120^◦C. Para la inoculaciónde T. harzianum y T. viride en los sustratos, se requirió de cultivos puros de los hongos, cada recipiente con el sustrato estéril, fue inoculado con 5ml de una suspensión de conidios, previamente preparada a una concentración de 108 conidios/ml, finalmente se incubó a 12 h luz/oscuridad a 26^◦C por10 días (^{Sivila, 2013}).

2.7 Fase de campo

2.8 Determinación del rendimiento de materia verde

Para determinar la producción de materia verde de la mezcla de pastos, de cada una de las unidades experimentales se procedió al corte de 1 m² con la ayuda de una hoz y de un cuadrante de varilla metálico, posteriormente con una motoguadaña se realizó el corte de igualación del resto de la unidad experimental. La biomasa fue colocada en fundas y pesada para determinar el rendimiento de materia verde.

2.9 Determinación de materia seca

De las muestras de pastos se tomaron 2 submuestras de 100 g cada una y sometidas a una temperatura de 105^◦C por 24 horas para así determinar el rendimiento en materia seca por diferencia de peso.

3.1 Identificación macroscópica de T. viride

Las colonias presentaron un crecimiento rápido (5-8 cm), el micelio logró cubrir la superficie de los medios de cultivo en 5 días a 26^◦C en Agar papadextrosa. Las colonias al inicio formaron pústulas algodonosas de un color blanco, posteriormente se compactaron y esporularon tomando un color verde de textura granular, con conidióforos ramificados visibles alrededor de la pústula. Los aislados nopresentaron el olor característico a coco; sin embargo al inverso de las colonias se puede observar visiblemente una coloración marrón-amarillenta, esto debido a la producción de cristales de color amarillo como se muestra en la Figura 1(c,d). Resultadosque concuerdan con las descripciones realizadaspor (^{Gams y Bissett, 1998}).

3.2 Identificación microscópica de T. viride

Tal como se muestra en la Figura 1(a,b), los conidióforos mostraron ramas laterales pareadas las mismas que forman un ángulo de 90^◦ con respecto al eje de donde surgen. Las fiálides presentaron una forma alargada, algo anchas en el centro y con un cuello alargado de color hialino. En ocasiones se observó fiálides individuales mientras que en otros casos se las encontró en grupos de 2 a 3. Las conidias observadas tenían forma ovoidal y a veces globosa, además tenían un color verde claro y los bordes lisos. Las conidias se presentaron incrustadas en las fiálides a manera de un racimo globoso de umbelas bien definidas. Todo lo anteriormente descrito fue comparado con las claves de identificación taxonómicas tanto de (^{Samuels et al., 1996}) como de (^{Gams y Bissett, 1998}) y concuerdan con la especie Trichoderma viride.

Figura 1. Estructuras microscópicas y macroscópicas de T viride. A) Conidios a los 5 días de incubación. B) Forma de los conidióforos.) C) Formación de anillos concéntricos. D) Pigmentación del medio. 

3.3 Identificación macroscópica de T. harzianum

Las colonias tuvieron un radio de 5 a 6 cm, con apariencia aterciopelada en sus etapas tempranas, el micelio presentó un color blanco sin embargo eventualmente fue desarrollando un color blanco verdoso hasta dar una tonalidad verde oliva, además se produjo la formación de anillos concéntricos los mismos que son característicos del género Trichoderma. Después de 7 días de incubación a 25^◦C las colonias presentaron un radio de 9 cm y cubriendo toda la superficie de la caja Petri y presentaron un color verde obscuro, fueron densas en el centro y se tornaron ondulatorias en los anillos concéntricos hasta llegar a los bordes. Todas las características mencionadas anteriormente fueron comparadas con las descripciones realizadas por ^{Gams y Bissett,(1998)}, así como también por las descritas por (^{Samuels et al., 1996}), mismas que concuerdan y correspondena la especie de Trichoderma harzianum y se observan en la Figura 2(c,d).

Figura 2. Estructuras microscópicas y macroscópicas de T. harzianum. A y B) Conidióforos a los 5 días de incubación. C) Formación de anillos concéntricos. D) Crecimiento en el medio. 

3.4 Identificación microscópica de T. harzianum

Los conidióforos observados a los 5 días de incubación presentaron una ramificación piramidal, “dentro de este sistema de ramificación se puede observar que las ramas o brazos que se encuentran más cercanos al eje principal son más largas”; esta descripción coincide con la hecha por (^{Samuels et al.,1996}), párrafo 1, este mismo autor señala que las ramas que se encuentran más cercanas a la punta forman un ángulo de 90^◦ con respecto al eje de donde nacen mientras que las ramas que se encuentran más lejanas a la punta forman un ángulo menor a 90^◦ con respecto al eje de donde surgen. “Las fiálides presentan forma de botella esto se debe a queson más anchas en el centro y se van comprimiendo fuertemente conforme se acercan a la punta hasta formar una especie de cuello”.

3.5 Rendimientos de materia verde y materia seca

El tratamiento que reportó un mejor desarrollo con un (p< 0, 001) durante los tres cortes realizados en la variable producción de materia verde, se presenta en la Figura 3, y fue T1 (Trichoderma harzianum + Materia orgánica + Fertilización alta) con una producción promedio de 12,72 TM/Ha/corte y T6 (Trichoderma viride + Materia orgánica + Fertilización baja). De igual forma T1 mostró el mejor comportamiento para la variable producción de materia seca con un promedio de 1,97 TM/Ha/corte. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en diferentes estudios donde se muestran que las cepas de Trichoderma promueven el crecimiento radicular en plantas de maíz y de algunos pastos, además mencionan que “al existir un incremento en la longitud de las raíces colonizadas por Trichoderma, las plantas de maíz y algunos pastos colonizadas por este hongo requirieron un 40% menos de fertilizantes nitrogenados” (^{Harman et al., 2004}), página 152. Por otro lado existen diversos trabajos donde se asegura que las especies de Trichoderma para poder colonizar las raíces de la planta son capaces sintetizar un sin número de sustancias como péptidos que actúan como promotores de crecimiento, esto es demostrado por ^{Wei Lin y Zhang, (2006)}, que mediante la aplicación de un proceso de fermentación líquida de Trichoder ma harzianum lograron obtener sustancias promotoras de crecimiento como ácido indolacético y ácido giberélico, las cuales son una clase de péptidos y son reconocidas como fitohormonas (^{Wei Lin yZhang, 2006}).

Cabe señalar que el aporte de materia orgánica jugó un papel importante en la producción tanto de materia verde como de materia seca, ya que en los tratamientos donde se agregó materia orgánica se registró un mejor comportamiento en comparación con el testigo y el tratamiento donde solo se utilizó fertilizante químico. La interacción (TH:1:A) presentó la mayor proporción de materia seca en gramos pero no tiene diferencia significativa con (TV:1:B), lo cual demuestra que la aplicación del hongo en presencia de materia orgánica puede reducir la cantidad de fertilizante sintético. Trichoderma tiene la capacidad de degradar la materia orgánica y solubilizar fosfatos orgánicos e inorgánicos mediante mecanismos quelantes y reductores (^{Cubillos et al., 2009}).

En el trabajo realizado por ^{Garcés (2011)}, se menciona que tanto “la altura como la producción de materia verde en alfalfa, se vieron incrementadas al añadir abono orgánico sólido enriquecido con Trichoderma, los abonos orgánicos presentan un elevado contenido de aminoácidos libres por lo que actúa como activador del desarrollo vegetal”, página 76.

Figura 3. Prueba de Duncan al 5% para la interacción Trichoderma*Materia orgánica*Fertilización en la variable materia seca (g). TV: T. Viride, TH: T. Harzianum, 0: sin materia orgánica, 1: con materia orgánica, A: Fertilización Alta, B: Fertilización Baja.