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Introducción
En la provincia de Loja, en la región Sur del Ecuador, se encuentra la mayor población de caprinos del país, su crianza se da a nivel de pequeños productores en sistemas extensivos, en donde el productor aprovecha la carne, la leche, la piel, el excremento; en estos ambientes prolifera la cabra “Chusca” de la provincia de Loja, que es un animal criollo, de gran rusticidad adaptada perfectamente al medio árido y semiárido del bosque seco, la conservación de este recurso ha generado en los últimos años investigaciones de gran importancia en la caracterización faneróptica, morfológica, genética, sin embargo no existe información sanitaria o de métodos o técnicas utilizadas para el diagnóstico de enfermedades.
La brucelosis es una enfermedad infecciosa abortiva, causada por una bacteria del género Brucella, la OIE [1] ha reportado B. mellitensis., en ovejas, cabras y en otras especies animales, entre el 2006 y 2015, 931.913 casos a nivel mundial, en este periodo Europa registra el mayor número de casos 614.266, en los animales afecta el tracto reproductor, ocasionando infertilidad, abortos o nacimiento de crías débiles [2-3]. Es también considerada la zoonosis más importante [4] que se transmite por contacto directo con animales o a través de fluidos como orina, sangre, semen, secreciones vaginales, heces, luego de abortos o partos a término por fluidos uterinos y la placenta [5-3], por aerosoles infectantes, consumo de leche y subproductos lácteos no pasteurizados, la Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que 4 de cada 10 habitantes viven en zonas donde se reconoce la presencia de la enfermedad [7].
El elevado porcentaje de abortos, el desconocimiento de las causas, la conservación de este recurso genético en condiciones sanitarias adecuadas, la investigación de esta bacteria por las afectaciones que ocasiona y su carácter zoonótico, son razones de importancia para realizar este estudio constituyéndose en el primer trabajo de investigación en los caprinos criollos.
Materiales y métodos
Área geográfica en estudio
Las muestras obtenidas para este estudio se recolectaron del bosque seco de la provincia de Loja, en el cantón Zapotillo, que tiene una temperatura promedio anual de 25.6 °C., del cantón Paltas en el valle de Casanga que tiene una temperatura promedio anual de 24 °C., del cantón Sozoranga, con una temperatura promedio anual de 18°C., y, del cantón Macará, de temperaturas entre 19 a 31°C
Población estudiada
Según ESPAC [8] 2018 la población de caprinos en la provincia es de 14953 de esta población, el 15% corresponden a animales criollos, lo que da una población de 2243 animales, de esta población el 65% son hembras (1346), las cabras en edad reproductiva corresponden al 40% (538). Para el cálculo de la muestra se utilizó el programa Epidad 4.2, con un margen de error de 12% y un NC DEL 95%, correspondiendo muestrear 60 cabras con un método de muestreo por conveniencia.
Toma de muestras
De cabras se extrajeron muestras de sangre total, con agujas de doble punta estéril, en tubo plástico tapa lila con vacío, para las pruebas de biología molecular, antes de tomar la muestra, se rotulo el tubo y se ingresó a la plantilla la respectiva identificación del animal, se llenó el tubo de sangre en sus 2 (dos) tercios tomando la muestra de la vena yugular y evitando movimientos bruscos, se colocaron en gradillas de espuma flex, se llevaron a conservación a -20 °C hasta su procesamiento
Extracción de ADN
Se realizó en el laboratorio de biología molecular de la Universidad Nacional de Loja, mediante el procedimiento manual de extracción según Romero y colaboradores 1995 [9], con adaptaciones a partir de 200 ul de sangre entera, la cuantificación se realizó en el Nano Drop 2000 y las pruebas de integridad de ADN se realizó en gel de agarosa al 1%
Detección de B. melitensis mediante PCR
Se optimizó la PCR en la que se utilizaron primers que amplifican un fragmento de 731 pb. B. melitensis-speciftc primer 5'-AAA, TCG, CGT, CCT, TGC, TGG, TCT, GA-3'. IS711-specific primer 5’-TGC, CGA, TCA, CTT, AAG, GGC, CTT, CAT-3' [10]. La preparación de la PCR se realizó a 25 ul en base a los siguientes parámetros.
Los parámetros de amplificación fueron:
Desnaturalización inicial 95°C/ 3 min. 35 ciclos de desnaturalización a 95°C/1 min, alineamiento a 64 °C/1 min, extensión a 72°C/ 1 min; y con una extensión final a 72°C/ 5 min, [10]. la amplificación se la realizó en el termociclador Bio Rad Icycler.
Para la electroforesis, se preparó un gel con TBE al 1X, agarosa al 1,5 %, adicionando 0.7 ul de Syber safe, se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb y los productos de PCR 0,8 ul de cada uno se combinaron con 0,2 ul de blue juice para ser depositados en cada pocillo del gel. Se programó la fuente de poder y se realizó la corrida durante 80 min a 80 voltios. La visualización del gel de electroforesis se realizó mediante el sistema de documentación ENDURO™ GDS Touch.
Discusión y resultados
Detección de B. mellitensis por PCR
De las 60 muestras procesadas no se obtuvieron reactores positivos a la prueba de biología molecular
En un estudio realizado en los años 2009-2010 en cabras del sector periurbano de Quito registró una seropositividad a brucelosis del 0.05 % [11]. Zabala y colaboradores [12]. investigando Brucella spp en la ciudad de Quito obtuvieron un 9,0 % de positividad en leche (PCR), 8,0 % en ganglios (PCR) y 17,8 % en suero (prueba de aglutinación), resultados que confirmaron la presencia de la bacteria en las cabras analizadas
Díaz-Lamiña [13] reportan el 0% de seroprevalencia de brucelosis caprina en Loja, mediante pruebas de biología molecular, en el 2015 Luna-Trueba [14], detectaron, por primera vez, B. mellitensis (2% de las muestras), en este estudio no se detectó la presencia de B. mellitensis en las muestras procesadas por PCR, sin embargo, se da cuenta de un problema abortivo de consideración en estos animales que debe ser investigado.
El 66.5% de abortos registrados mediante la encuesta epidemiología se relaciona posiblemente con el reporte de Mellano [15] en México, que en las zonas áridas y semi áridas existen un máximo del 70% de pérdidas fetales. Mellano and Pastor, [16] mencionan que las pérdidas por abortos constituyen la principal falla reproductiva de los caprinos en sistemas extensivos donde se presenta una restricción alimenticia durante la gestación, que obedece a la particular estrategia reproductiva de la cabra, la cual “responde” al estímulo del macho, aun con bajas reservas corporales de energía, y una vez gestante, la cabra continúa o suspende la preñez, según la disponibilidad de nutrientes.
