2.1 Materiales

Las inflorescencias de cannabis (C. sativa L.) empleadas en este estudio fueron suministradas por empresas autorizadas para el cultivo y la investigación en Ecuador, todas ellas con licencias emitidas por el Ministerio de Agricultura. Las siguientes variedades fueron analizadas en este estudio: 1) Cherry Oregon (EEUU), con una concentración de 10.10 % p/p de CBD y 0.76 % p/p de THC, según su ficha técnica (CANNANDES S.A., Tabacundo); 2) Titan y Cherry Bubblegum (EEUU), con contenidos de CBD de 10.59 % p/p y valores de THC de 0.364 % p/p y 13.84 % p/p de CBD y 0.551 % p/p de THC, respectivamente (CBD SOLUTIONS S.A.S., Cotogchoa); 3) Lemonge (EEUU), con un perfil de cannabinoides de 17 % p/p CBG y 0.1 % p/p THC (PHOENICIAN FARMS S.A.S., Poaló); 4) Medicinal Esmeralda 16 (EM-16) y Medicinal Esmeralda 19 (EM-19) (Colombia) con concentraciones de 16.78 % p/p CBD y 0.55 % p/p THC, y 15 % p/p CBG y 0.1 % p/p THC, respectivamente (AITANA S.A.S., San Antonio de Pichincha).

Las muestras se manipularon bajo condiciones controladas (humedad: 40-55 %, temperatura: 18-22 °C) para preservar sus compuestos fitoquímicos y asegurar la exactitud de los análisis. Las condiciones climatológicas de cultivo se detallan en la Tabla S1 del material suplementario.

En el proceso experimental se empleó agua ultrapura tipo Milli-Q, disolventes grado ACS y gases ultrapuros. Para la identificación y cuantificación de cannabinoides se utilizaron estándares de CBD, THC, CBG y CBN, junto con una mezcla de terpenos A (β-mirceno, limoneno, cariofileno, linalool, naftaleno) de Sigma-Aldrich. Las cannaflavinas A y B fueron suministradas por LGC standards. El análisis de metales pesados se realizó mediante absorción atómica con patrones de Sigma-Aldrich.

2.2 Métodos

Para evaluar los rendimientos y la caracterización química, se aplicaron por triplicado tres métodos de extracción: fluido supercrítico (SFE), sólido-líquido (SLE) y ultrasonidos (UEA), se usó 5 g de inflorescencias de cannabis no psicoactivo (<2 mm). Tras la extracción, los extractos se filtraron al vacío y almacenaron en placas de Petri. Luego, se sometieron a un tratamiento térmico en dos etapas: 75 °C durante 1 hora y 120 °C por 20 min para completar la descarboxilación (^{Wang et al., 2016}). Finalmente, los extractos se refrigeraron para su posterior análisis. Los procedimientos se detallan a continuación:

2.2.4. Métodos analíticos para determinar el contenido de taninos, flavonoides y polifenoles totales

Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis Agilent Cary 60 para analizar la presencia de taninos, flavonoides y polifenoles totales. El análisis de taninos siguió la metodología descrita por ^{Herrera-Fuentes et al. (2017}) con modificaciones específicas. La preparación de la muestra consistió en pesar 10 gramos de inflorescencia de cannabis triturada, se mezcló con 500 mL de etanol al 50 % (v/v) y se agitó durante 6 horas. El resultado necesitó un reposo de 8 horas antes de la filtración. La filtración requirió una dilución previa de 3 mL de muestra en 50 mL de agua destilada. La solución patrón consistió en ácido tánico a una concentración de 0.05 mg/mL, y la absorbancia de la solución correspondió a una longitud de onda de 700 nm.

El análisis de flavonoides totales siguió el protocolo de ^{Ortíz Fernández et al. (2016}). Este procedimiento establece una mezcla de 0.5 gramos de inflorescencia de cannabis molida, 20 mL de ácido sulfúrico y 20 mL de etanol. Esta mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas, seguida de filtración al vacío. A continuación, se lava el residuo con 30 mL de etanol al 96 % (v/v), se evapora el filtrado para reducir su volumen a la mitad y se disuelve en 70 mL de etanol al 96 % (v/v) (previamente calentado a 50 °C). Esta mezcla se hirvió, el volumen se ajustó a 100 mL con etanol al 96 % (v/v), y la mezcla se almacenó a 4 °C. Además, se preparó quercetina disuelta en etanol a una concentración de 0.8 mg/mL como solución estándar, y se determina la concentración de flavonoides en las muestras a una longitud de onda de 258 nm.

Para determinar los polifenoles totales, nos basamos en la metodología descrita por ^{García et al. (2015}). Este método consiste en extraer de una mezcla de 1 gramo de inflorescencias molidas en 75 mL de metanol al 70 % v/v y agitar durante 45 minutos. Posteriormente, se filtró el extracto y se ajustó el volumen a 100 mL con metanol de la misma concentración. A continuación, se mezcló 1 mL de esta mezcla con 6 mL de agua destilada y 1 mL de reactivo Folin & Ciocalteu, tras lo cual se dejó reposar la mezcla durante 3 minutos. Por último, se añadieron 2 mL de una solución de carbonato sódico. La preparación del patrón reproduce el procedimiento anterior, incluidos los pasos de reacción y dilución. La calibración emplea soluciones patrón de ácido gálico con concentraciones comprendidas entre 5 y 200 µg/mL, obteniéndose coeficientes de determinación (R²) iguales o superiores a 0.998 (Figura S1).

2.2.5. Cannabinoides y cannaflavinas

La cuantificación e identificación de cannabinoides (CBD, THC, CBG, CBN) y flavonoides (cannaflavina A y cannaflavina B) se realizó con un sistema de cromatografía líquida HPLC Agilent Infinity 1290 equipado con un detector de matriz de diodos. Se siguieron las directrices de la AOAC 2018.11 para el análisis y preparación de muestras (^{Lapwibulsuk et al., 2023}). Así, 0.50 ± 0.01 g de muestra se mezclaron con 20 mL de etanol de grado ACS durante 20 min a 250 rpm. El sobrenadante se centrifugó y se separó del etanol, y se añadió un nuevo disolvente para repetir la extracción dos veces. Se filtró una alícuota de 3 mL (PTFE, 0.22 µm) y se diluyó 10 veces o 100 veces (según fuera necesario para ajustarla a la curva de calibración) con metanol. La dilución final se transfirió a un vial de HPLC y se analizó como se ha descrito anteriormente. La columna utilizada fue una columna Teknokroma Mediterranean SEA18 (3 µm, 10 × 0.4 mm) con una temperatura de 25 °C. La fase móvil consistió en un gradiente de formiato de amonio (20 mM, pH 3.2) como fase A y acetonitrilo como fase B, ajustado según las condiciones especificadas en la Tabla 1. La concentración de la solución estándar fue de 5 µg/mL, y las longitudes de onda de detección fueron 240 nm para los cannabinoides y 340 nm para las cannaflavinas.

Se generaron curvas de calibración a partir de la inyección de volúmenes variables de soluciones estándar que iban de 5 a 40 µl, lo que generó coeficientes de correlación (R²) iguales o superiores a 0.998 y límites aceptables de detección y cuantificación (Ver Figuras S2-S7).

Tabla 1 Detalles del gradiente de fase móvil utilizado para el análisis de cannabinoides 

Rendimientos de extracción de inflorescencias de cannabis no psicoactivo

El parámetro utilizado para comparar cada método de extracción fue el rendimiento del extracto de espectro completo de las inflorescencias estudiadas. Este parámetro relaciona la cantidad de producto o extracto obtenido con respecto a la cantidad de materia prima utilizada. También se empleó la tasa de extracción de cada método, que es la relación entre el rendimiento y el tiempo consumido en cada extracción. Esta métrica ofrece una visión más integral de la eficacia de los métodos, ya que toma en cuenta tanto la cantidad de producto obtenido como el tiempo requerido para cada procedimiento.

Figura 1 Rendimientos obtenidos para cada método de extracción de inflorescencias de cannabis no psicoactivo 

En comparación con el método de maceración y fluidos supercríticos, el método de extracción asistido por ultrasonidos (UEA) puede generar un mayor rendimiento. Sin embargo, como se ilustra en la Figura 1, no hay diferencias significativas con el método de maceración, ya que sus valores máximos de rendimiento son similares (13.44 % p/p UEA y 12.96 % p/p MAC). Esta tendencia concuerda con el estudio de ^{AL Ubeed et al. (2022}), en donde el método de maceración como el de ultrasonidos obtuvieron valores cercanos al 25 % p/p. Por otro lado, el método de extracción con fluido supercrítico (SFE) resulta el de menor rendimiento de extracción, con valores que pueden alcanzar la mitad de los otros métodos. Esto se debe a la naturaleza altamente selectiva del CO₂ supercrítico, que gracias a sus propiedades de solubilidad, viscosidad y polaridad se enfoca a obtener compuestos específicos como los cannabinoides en lugar de una extracción de amplio espectro.

Se realizó un ANOVA (análisis de la varianza) para cada método de extracción (Tabla 2) con el fin de identificar los factores que influyen significativamente en el rendimiento del extracto de espectro completo. Este análisis estadístico ayuda a determinar qué variables, como la temperatura, la presión y el tiempo, influyen considerablemente en la eficacia de la extracción y, por tanto, ayuda a optimizar las condiciones de extracción para maximizar los rendimientos.

Tabla 2 Análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey para los métodos de extracción (α=0.05) 

Se utilizó la prueba de Tukey al 95 % de confianza.

La Tabla 2 presenta los resultados del análisis de varianza (ANOVA) para los métodos de extracción asistida por ultrasonidos (UEA) y maceración. En este análisis se identificaron dos factores significativos con valores-p inferiores a 0.05: “variedad” y “temperatura”. Además, no hay interacciones significativas entre estos factores. Al aplicar la prueba de rango múltiple para los factores significativos, es posible identificar qué condiciones mejoran el rendimiento del extracto.

Por ejemplo, en la Tabla 2 se muestra que la variedad con el mayor rendimiento para ambos métodos de extracción fue Titan, con un 17.44 ± 0.19 % p/p para la extracción asistida por ultrasonidos (UEA) y un 16.89 ± 0.20 % p/p para la maceración (MAC). Por el contrario, la variedad con el rendimiento más bajo para ambos métodos fue Lemonge, con un 9.25 ± 0.19 % p/p para la UEA y un 9.46 ± 0.21 % p/p para el método MAC. Además, la Tabla 2 indica que el segundo factor significativo, la temperatura, revela que los mejores rendimientos tanto para UEA como para MAC se alcanzaron a la temperatura experimental más alta de 16 °C.

Un estudio realizado por ^{Radoiu et al. (2020}) comparó los métodos de extracción por ultrasonidos, microondas, disolventes y fluidos supercríticos y concluyó que los métodos por ultrasonidos y microondas son los más eficientes desde una perspectiva ecológica debido a su menor consumo de disolventes. Por otro lado, para el método de maceración (MAC), las temperaturas de 16°C y 0 C produjeron los mejores rendimientos, con valores de 13.41 ± 0.14 % p/p y 13.05 ± 0.15 % p/p, respectivamente.

Los factores no significativos, como el tiempo para la extracción asistida por ultrasonidos (UEA) y la maceración (MAC), así como la temperatura y la presión para la extracción con fluido supercrítico (ESF), indican que estos factores no tienen un efecto considerable en el rendimiento final de la extracción. Así, en la Tabla 2 se puede observar que no existen valores mínimos ni máximos asociados a estos factores, ya que el rendimiento obtenido es similar independientemente del tiempo en UEA y MAC o de la temperatura y presión en SFE.

Los resultados del ANOVA presentados en la Tabla 2 para el método de extracción con fluido supercrítico (SCF) revelan que el único factor estadísticamente significativo es el factor “Variedad”, con un valor p inferior a 0.05. No se registraron interacciones para estos métodos de extracción.

La Tabla 2 indica que la variedad Titan presentó el mejor rendimiento para el método de fluido supercrítico, con un 8.1 ± 0.35 % p/p, mientras que la variedad Lemonge presentó el rendimiento más bajo, con un valor de 1.8 ± 0.30 % p/p. La comparación de estos resultados con los obtenidos por ^{Jokić et al. (2022}) reveló que su mayor rendimiento fue del 8.83 % a 361.4 bar de presión y 50 °C, mientras que el mayor rendimiento de la variedad Titan se obtuvo a 325 bares de presión y 55 °C.

Algunos de los altos rendimientos de los métodos de maceración (MAC) y asistidos por ultrasonidos (UEA) pueden atribuirse al tipo de disolvente utilizado. El alto poder de disolución y la naturaleza dipolar del etanol le permiten disolver un espectro completo de metabolitos secundarios, incluidos cannabinoides, terpenos y flavonoides. Sin embargo, también puede arrastrar moléculas hidrosolubles no deseadas, como clorofila, glucósidos, azúcares y sales de alcaloides, que pueden eliminarse en procesos posteriores, como el winterizado, para cumplir los requisitos de la FDA (^{López-Olmos et al., 2022}). Por otro lado, el CO₂ supercrítico tiende a ser selectivo para las moléculas de cannabinoides y terpenos en el proceso de extracción supercrítica; por lo tanto, los rendimientos pueden verse menos afectados por la materia prima que entra en el proceso (^{Rovetto & Aieta, 2017}). El método de ultrasonidos, que es el que mayor tasa de extracción presenta, podría ampliarse para aumentar la producción; sin embargo, los costes asociados podrían resultar en una inversión significativa.

La Tabla 3 muestra las condiciones que generan un mayor rendimiento para cada método de extracción. Los factores no significativos, como el tiempo de extracción en los métodos de maceración y extracción asistida por ultrasonidos, pueden ajustarse a los valores más bajos para minimizar el consumo de energía. De manera similar, en la extracción con fluido supercrítico, la temperatura y la presión, al no ser factores significativos, pueden seleccionarse en sus valores más bajos con el fin de reducir el consumo energético.

Tabla 3 Condiciones de extracción y análisis de los resultados de MANOVA para cannabinoides en inflorescencias de cannabis no psicoactivo (α=0.05) 

Análisis de cannabinoides en inflorescencias de cannabis no psicoactivo y sus extractos

La mayor concentración de cannabinoides se encuentra en las inflorescencias, razón por la cual el control de calidad se ha centrado en analizar esta parte de la planta. El MANOVA (Tabla 3) reveló diferencias significativas en el contenido de cannabinoides según la variedad en todos los métodos de extracción, y según la temperatura en el método de extracción asistida por ultrasonidos. No se observaron interacciones ni correlaciones entre los factores. La variedad influye en las concentraciones de CBD, THC, CBN y CBG, lo cual concuerda con ^{Wilson et al. (2022}), quienes observaron diferencias en el contenido de CBD entre variedades, a pesar de usar condiciones de extracción idénticas. Además, la temperatura en ultrasonido mostró una relación directa con la concentración de cannabinoides.

Para preservar compuestos volátiles como terpenos y flavonoides, la descarboxilación se realizó en los extractos, no en las inflorescencias. Este proceso, basado en ^{Gallo et al. (2020}), aumenta la conversión de cannabinoides ácidos a formas activas. Estos compuestos aportan beneficios para la salud y características organolépticas ^{Lewis et al. (2017}). Se utilizó HPLC para identificar formas ácidas y neutras ^{Nahar et al. (2020}), mientras que la cromatografía de gases (GC) permitió convertir parcialmente las formas ácidas a activas debido a temperaturas superiores a 200 °C (^{García-Valverde et al., 2022}). La descarboxilación inicia alrededor de los 100 °C.

La cuantificación total de cannabinoides se realizó con la suma de las formas ácida y activa, en cumplimiento con la normativa ecuatoriana (Ministerio de Agricultura y Ganadería, 2020; United ^{Nations, 2022}). Este análisis integral permite evaluar la eficacia de los métodos de extracción y descarboxilación.

La Figura 2 muestra que la variedad Titan presentó la mayor concentración de CBD (18.15 % p/p), mientras que Lemonge tuvo el mayor contenido de CBG (10.83 % p/p). Todas las muestras cumplieron con el límite legal de THC (<1 %). En variedades ricas en CBG como Lemonge y EM-19, los niveles de CBD y THC fueron nulos, debido a que el CBG es precursor biosintético de otros cannabinoides (^{Chen & Pan, 2021}). ^{Kleinhenz et al. (2020}) reportó concentraciones similares en cáñamo industrial, con menos de 3.29 % p/p en inflorescencias y menos de 0.1 % en otras partes de la planta.

Los resultados de cannabinoides obtenidos a partir de inflorescencias de cannabis no psicoactivas difieren de los valores facilitados en las fichas técnicas comerciales. Por ejemplo, la variedad Titan, según su ficha técnica, debería tener un contenido en CBD del 10.59 % y un contenido en THC del 0.36 %. Sin embargo, los análisis realizados para los cultivos realizados en Ecuador muestran valores del 18.15 % para el CBD y del 0.34 % para el THC. La Tabla 4 muestra estas diferencias entre los valores de la ficha técnica comercial y los resultados de las variedades cultivadas en Ecuador. Estas diferencias pueden deberse a diversos factores, como la calidad de la semilla, el clima, el tipo de suelo, la ubicación geográfica, el estrés y el uso de fertilizantes orgánicos en Ecuador (^{Jiménez Álvarez et al., 2019}).

Figura 2 Análisis de cannabinoides totales por variedades en las inflorescencias de cannabis no psicoactivo 

Tabla 4 Comparación entre los valores de cannabinoides analizados en inflorescencias cultivadas en Ecuador y las fichas técnicas comerciales 

Subíndice t: Valores de la ficha técnica. Subíndice v: Verificación por los autores (método AOAC)

Las variedades de cannabis estudiadas presentan altos contenidos de CBD o CBG y menos del 1‌ % de THC, en conformidad con lo establecido por el COIP (2019). Las variedades americanas Cherry Oregon, Cherry Bubblegum y Titan mostraron mayor contenido de CBD en Ecuador, posiblemente por su adaptación a condiciones locales como altitud, clima y suelos. Titan alcanzó alta concentración de CBD en Cotogchoa (2614 m. s. n. m., 14-15 °C anuales, 86 % HR) (ver Tabla S1). En cambio, las variedades ricas en CBG mostraron menores concentraciones que sus fichas técnicas, posiblemente por estrés térmico y altitud (>2450 m. s. n. m.). Las semillas podrían requerir mayor adaptación. La Tabla 5 presenta los promedios estadísticos del rendimiento según la variedad y método de extracción más eficiente.

Tabla 5 Porcentajes medios del extracto de cannabinoides, según el método de extracción y variedad 

En la Figura 3 se presentan los resultados de las concentraciones de cannabinoides obtenidos en los extractos para cada método de extracción, que se basan en el factor significativo “variedad”. Esta figura muestra las concentraciones más altas de cada cannabinoide para las variedades de cannabis analizadas. Para el cannabigerol (CBG), la concentración más alta se obtuvo con la variedad EM-19 mediante ultrasonidos con un valor de 67.77 % p/p. La concentración más baja de CBG se registró para la variedad Lemonge con fluidos supercríticos, con un 7.69 % p/p. Por otra parte, el cannabinol (CBN) está presente en concentraciones muy bajas, ya que no se produce de forma natural en las plantas, sino que procede de la oxidación del THC (^{Scholz et al., 2022}).

Figura 3 Resultados de la concentración de cannabinoides en el extracto para cada método de extracción 

La Figura 3 muestra que la concentración de 9 tetrahidrocannabinol (THC) es significativamente menor que la de CBD; sin embargo, la mayor concentración de THC en los extractos se observó en la variedad Titan mediante el uso de fluidos supercríticos, donde se reportó un valor del 6.32% Los porcentajes de cannabinoides aumentan de forma significativa tras la extracción de la inflorescencia y continúan elevándose conforme avanza el proceso de refinamiento (destilación, cromatografía preparativa), hasta alcanzar su aislamiento completo. (King, 2019)

Además, la mayor concentración de cannabidiol (CBD) se logró con la extracción con fluidos supercríticos con un valor de 44.65 % p/p y ligeras variaciones de mas/menos 1 % en comparación con los otros métodos. Los fluidos supercríticos tienen un potencial de extracción medio-bajo para cannabinoides y terpenos debido a sus características de solubilidad (^{Valizadehderakhshan et al., 2021}). Por el contrario, el etanol por su bipolaridad es más soluble para varios metabolitos secundarios y compuestos no deseados, lo que requiere un paso posterior de “winterización” para precipitar los compuestos no deseados, como las grasas, para lo cual se reduce la temperatura por debajo de -40 °C. ^{Grijó et al. (2018}) informó de una disminución de la concentración de cannabinoides tras el proceso de winterización. Además, ^{King (2019}) sugirió que la solubilidad de los cannabinoides en la extracción con etanol depende de la temperatura, mientras que el método de fluidos supercríticos puede lograr una mayor solubilidad mediante el ajuste de la presión y la temperatura del CO₂.

Otro factor importante para la comercialización de extractos de cannabis no psicoactivo es la remediación del THC, ya que este compuesto está estrictamente regulado en varios países. Según ^{Luca et al. (2023}), los modos avanzados de cromatografía líquido-líquido (LLC) mediante operaciones sencillas y una buena productividad puede llevarse a cabo para la remediación de este compuesto.

Las pruebas de rango múltiple realizadas para cada cannabinoide mostraron que temperaturas más altas y tiempos más largos favorecen concentraciones más altas de cannabinoides en los métodos de maceración y ultrasonido, resultados que se alinean con los obtenidos por ^{De Vita et al. (2020}). Por el contrario, el método de fluido supercrítico mostró un rendimiento de extracción entre el 70 % p/p y el 85 % p/p a temperaturas entre los 35 a 45 °C y presiones entre 300 a 325 bar.

Identificación del perfil de terpenos en extractos de inflorescencias de cannabis no psicoactivo

El contenido de terpenos en inflorescencias no psicoactivas de cannabis depende principalmente de la variedad (^{Sommano et al., 2020}). Las inflorescencias presentan la mayor concentración de terpenos de toda la planta (^{Jin et al., 2020}), y su extracción debe realizarse sin demoras para evitar pérdidas por volatilización (^{Bueno et al., 2020}). Además, el rendimiento varía según el método de extracción.

SFE permitió extraer eficazmente monoterpenos y sesquiterpenos, incluyéndose compuestos con propiedades terapéuticas. El β-cariofileno posee efectos antiinflamatorios y anticancerígenos; el bisabolol, propiedades antimicrobianas y antimutagénicas; mientras que el nerolidol, actividad antifúngica y ansiolítica (^{Cox-Georgian et al., 2019}).

En la Figura 4, se identificaron 10 terpenos por maceración (a), entre ellos el β-cariofileno, humuleno, bisabolol y mirceno. Con ultrasonido (b), se añadió citronelol y no se detectó cedreno. La extracción con fluidos supercríticos (SFE) (c) identificó 14 terpenos, entre ellos α/β-pineno, flavanona y (R)-(+)-limoneno, lo que evidencia una mayor selectividad.

Para la maceración, el bisabolol fue más abundante en Cherry Bubblegum (31 µg/g), y el β-cariofileno en EM-16 (26.6 µg/g). El mirceno y cedreno fueron los menos abundantes (0.4 y 0.2 µg/g en EM-19). Las temperaturas elevadas (>100 °C) durante la descarboxilación pudieron causar la pérdida de monoterpenos (^{Ascrizzi et al., 2020}).

En UEA, también con etanol anhidro, se observaron perfiles similares, aunque el citronelol solo fue detectado con este método. Las concentraciones fueron mayores en SFE, atribuido a la solubilidad de terpenos en CO₂ supercrítico (4.6 g/100 g) frente al etanol (2.14E-4 g/100 g) (^{Eddin et al., 2022}). El bisabolol alcanzó 49.6 µg/g en Cherry Oregon, mientras que el mirceno fue el menos abundante (0.4 µg/g en Lemonge). El cedreno solo se detectó en maceración, y el citronelol únicamente en UEA, lo que visualiza la influencia del método en el perfil de terpenos (^{Rocha et al., 2020}).

En la Figura 4, también se observa que SFE identificó más terpenos (14) que MAC y UEA (10 cada uno). SFE también arrojó mayores concentraciones, destacándose el β-cariofileno (320.79 ppm en Cherry Bubblegum), humuleno (73.84 ppm), bisabolol (143.57 ppm), mirceno (42.17 ppm) y nerolidol (37.35 ppm).

El bisabolol y el β-cariofileno fueron los terpenos más abundantes en todas las variedades. SFE resultó el método más eficiente, seguido de UEA y luego MAC. La cavitación ultrasónica puede provocar evaporación de terpenos volátiles por elevadas temperaturas locales (> 100 °C) (^{Hoo et al., 2022}).

Identificación de cannaflavinas, flavonoides totales, polifenoles totales y taninos

Las cannaflavinas A y B son flavonoides presentes en el cannabis con potentes propiedades antiinflamatorias. Estudios han demostrado que la cannaflavina A inhibe la producción de PGE2, una molécula asociada con la inflamación, hasta treinta veces más efectivamente que la aspirina (^{Barrett et al., 1986}). La Figura 5 muestra que la variedad EM-19 tiene la concentración más alta de cannaflavina A en todos los métodos de extracción. Esto generó un rendimiento máximo de 0.32 % p/p a través de la maceración. Por otra parte, la cannaflavina B se encontró en concentraciones relativamente altas en la variedad Cherry Bubblegum, con un valor máximo de 0.11 % p/p, que también se obtuvo a través de la maceración.

La variación en la concentración de cannaflavina se debe principalmente a la genética de cada variedad de cannabis. Sin embargo, los valores de cannaflavinas A y B obtenidos a través del método de extracción con fluidos supercríticos son inferiores a los obtenidos a través de los otros métodos de extracción. Este comportamiento contrasta con la extracción de terpenos, donde la extracción con fluidos supercríticos fue más efectiva. La concentración globalmente baja de cannaflavinas podría estar relacionada con condiciones de crecimiento subóptimas, como altas temperaturas y poca luz solar, durante las primeras etapas de la floración (^{Pavlovic et al., 2019}).

Figura 5 Concentración de cannaflavinas en extractos obtenidos por los diferentes métodos. 

Un estudio de Barrientos Ramírez et al. (2019) sugiere que la capacidad antioxidante es mayor en plantas silvestres que en cultivadas, donde el efecto más pronunciado está en frutos y hojas. Estas partes de la planta contienen una mayor abundancia de metabolitos secundarios con propiedades antioxidantes, como flavonoides, polifenoles y taninos. Estos compuestos han mostrado efectos bioquímicos y antioxidantes beneficiosos, los cuales se asocian con la prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple (^{Panche et al., 2016}). Adicionalmente, algunos flavonoides tienen propiedades antiinflamatorias y neuroprotectoras (^{Murti et al., 2012}).

En la Figura 4 se muestra el porcentaje de flavonoides totales (d) en las diferentes variedades de cannabis estudiadas. Las variedades Cherry Bubblegum y Cherry Oregon presentaron las concentraciones más altas, con valores de 2.28 % p/p y 2.27 % p/p, respectivamente. ^{Tomko et al. (2020}) reportaron valores similares de flavonoides totales y señalaron que estos compuestos pueden representar hasta 2.5 % del peso seco de ciertas partes de la planta de cannabis. Los resultados reportados en dicho estudio se alinean con los datos obtenidos en el presente estudio, lo que refuerza la consistencia y validez de nuestras mediciones en las variedades de cannabis analizadas.

Los polifenoles son compuestos con propiedades antioxidantes que ayudan a prevenir la oxidación de las lipoproteínas LDL, así como la actividad de agentes microbianos, mutagénicos e inflamatorios (^{Quiñones et al., 2012}). El literal (e) de la Figura 4 muestra la concentración de polifenoles totales en diferentes variedades de inflorescencias de cannabis, donde se destacó la variedad Lemonge con la mayor concentración (130.91 mg/g) y EM-19 la menor (37.97 mg/g). En contraste con los resultados de Barrientos Ramírez et al. (2019), quienes estudiaron los polifenoles totales en frutos de plantas silvestres, y Physalis chenopodifolia Lam, y reportaron valores de 196.46 mg/g y 9.44 mg/g, respectivamente. Esto sugiere que la concentración de antioxidantes en inflorescencias de cannabis cultivadas en invernadero puede compararse con la de algunas plantas silvestres. Adicionalmente, ^{Buenrostro-Figueroa et al. (2023}) reportaron que el contenido total de polifenoles en cáscaras de granada oscila entre 127.67 ± 2.64 mg/g y 189.93 ± 4.40 mg/g, lo cual es similar al contenido de polifenoles encontrado en la variedad Lemonge.

Los taninos son compuestos químicos naturales presentes en las plantas que presentan propiedades antioxidantes, antibacterianas y antifúngicas. El literal (f) de la Figura 4 muestra que la variedad EM-16 tiene la mayor concentración de taninos, con un 0.99 % p/p. Estos resultados concuerdan con los de ^{Tong et al. (2022}), que investigaron la función biológica de los taninos vegetales en la salud animal e informó de que concentraciones de taninos del 0.13 %, 0.45 % y 2.25 % mejoraron significativamente los índices de conversión del pienso y reducían las concentraciones de amoníaco. Además, otros estudios han demostrado que los taninos pueden ejercer efectos protectores contra las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y el cáncer (Thompson, 1993).

Estas propiedades hacen que los taninos sean de gran interés en la investigación médica y farmacéutica, tanto por sus beneficios directos para la salud como por su potencial en el desarrollo de tratamientos y suplementos dietéticos con propiedades antioxidantes y antimicrobianas.

La variedad EM-19 presentó los valores más bajos de flavonoides totales, polifenoles totales y taninos; sin embargo, presentó la mayor concentración de cannaflavina A.

Análisis de pesticidas en inflorescencias de cannabis no psicoactivo

La Tabla 6 muestra los resultados para los análisis de contaminación química tanto por pesticidas y metales pesados.

Según los resultados mostrados en la Tabla 6 para pesticidas, los compuestos organoclorados y organofosforados están por debajo del límite de detección del equipo de GC, lo que indica la ausencia de estos compuestos en las muestras analizadas. Estos resultados sugieren que los cultivos se desarrollaron de forma orgánica, sin el uso de compuestos químicos nocivos y tóxicos para la salud humana.

Figura 4 Análisis de: Terpenos en extractos por a) Maceración, b) Ultrasonido y c) Fluidos Supercríticos en donde: 1: Cariofileno, 2: Humuleno, 3: Bisabolol, 4: Mirceno, 5: Nerolidol, 6: Linalool, 7: Fenchol, 8: Acetato de geranilo, 9: Cedrol, 10: Cedreno, 11: Citronelol, 12: α-Pineno, 13: β-Pineno, 14: Fenchona, 15: Limoneno; d) Flavonoides Totales; e) Polifenoles Totales; y f) Taninos presentes en inflorescencias de cannabis no psicoactivo. 

Tabla 6 Resultados de análisis de contaminación química para pesticidas y metales pesados en inflorescencias de cannabis no psicoactivo 

O.C.: Organoclorados; O.P.: Organofosforados

Estos resultados demuestran que los cultivares de inflorescencias de cannabis no psicoactivas se destinan al procesamiento para usos farmacéuticos y alimentarios, lo que refleja las buenas prácticas agrícolas y la gestión responsable de los pesticidas e insecticidas orgánicos. La biofumigación es una técnica emergente que gana popularidad como método para obtener productos de mayor calidad con menor impacto en la salud del consumidor (^{Aysanew & Alemayehu, 2022}).

Identificación de metales pesados en inflorescencias de cannabis no psicoactivo

En Ecuador, la contaminación del agua afecta a la mayoría de los cuerpos hídricos debido a descargas de actividades industriales y comerciales, lo que compromete las fuentes de riego en zonas agrícolas. Esta situación genera presencia de nitratos, cloruros, sulfatos y metales pesados como el mercurio, asociado también al uso de fertilizantes y plaguicidas (^{Taco et al., 2017}).

Según la Tabla 6 y lo establecido en la Guía armonizada ICH Q3D (R1) (International Conference on Harmonisation (ICH), 2019) para valores máximos permisibles en fármacos, productos farmacéuticos y excipientes en dosis oral no mayor a 10 g diarios, todas las muestras de inflorescencias de cannabis superaron el límite permitido de plomo (0.5 ppm). Esta presencia se relaciona con el tipo de suelo, calidad del agua y fertilización. En contraste, los niveles de arsénico y mercurio se mantuvieron por debajo de los máximos establecidos, lo que representa un hallazgo favorable. En el caso del cadmio (límite 0.5 ppm), las muestras Lemonge (2.09 ppm) y Titán (0.60 ppm) excedieron ese valor.

Lemonge se cultiva en Poaló, Cotopaxi, zona de suelos volcánicos, lo que puede explicar su contenido metálico. En Titán, cultivada en Cotogchoa, Pichincha, la fertilización durante la etapa vegetativa podría haber influido (^{Caplan et al., 2017}). El cromo también apareció en concentraciones elevadas en Cherry Oregon (2.60 ppm) y Titán (1.40 ppm); sin embargo, estos valores no superan el límite establecido en 1100 ppm. Estos niveles podrían restringir su comercialización, aunque los extractos tienden a retener trazas mínimas (^{González-Torres et al., 2023}).

Bajo esta perspectiva, el cáñamo industrial se reconoce como una planta hiperacumuladora de metales pesados, particularmente en sus raíces (^{Golia et al., 2023}; ^{Placido & Lee, 2022}). En este sentido, su cultivo previo al establecimiento de cannabis con fines medicinales podría constituir una estrategia eficaz para reducir la concentración de contaminantes presentes en las flores destinadas a uso terapéutico.

Los resultados obtenidos en la caracterización del cannabis en este estudio podrían estar influenciados por la menor presión parcial de CO₂, las temperaturas reducidas y la variabilidad de la precipitación anual, condiciones propias de las zonas de investigación en Ecuador que ejercen un impacto significativo sobre el perfil fitoquímico de la planta. Estas particularidades ambientales, características de las regiones altoandinas del país, se han asociado con adaptaciones bioquímicas específicas en el cannabis (^{Solís García et al., 2025}).

4. CONCLUSIÓN

Este estudio demostró que el método de extracción influye significativamente en el rendimiento y la composición química de los extractos de cannabis no psicoactivo cultivados en Ecuador. La extracción por ultrasonidos alcanzó el mayor rendimiento en extractos de espectro completo (17.44 % p/p en Titan), mientras que la extracción con fluidos supercríticos destacó por su eficiencia en la obtención de cannabinoides, logrando 44.65 % p/p de CBD en Cherry Oregon y 6.32 % p/p de THC en Titan, sin dejar residuos de disolventes, lo que la hace especialmente adecuada para aplicaciones alimentarias y farmacéuticas.

Además, este método permitió obtener las mayores concentraciones de terpenos en Cherry Bubblegum (β-cariofileno, bisabolol), mientras que en cannaflavinas, se observó un mayor contenido de cannaflavina A en EM-19 (0.32 % p/p) y de cannaflavina B en Cherry Bubblegum (0.11 % p/p), ambas mediante maceración. La variabilidad en polifenoles, flavonoides y taninos estuvo asociada a factores genéticos y ambientales como la altitud y el tipo de suelo. Aunque los residuos de pesticidas fueron bajos, se detectaron niveles elevados de metales pesados (Cd, Cr) en algunas variedades. Se recomienda implementar tratamientos de agua, biorremediación del suelo y control del sustrato para garantizar la inocuidad de la materia prima.