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INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es un trastorno infeccioso de animales y humanos. Es la infección zoonótica más común del mundo 1, descrita primariamente por Adolf Weil en 1886 2, Stimson en 1907 preparó secciones del cerebro, hígado, corazón y riñón, en los túbulos del riñón visualizó lo que denominó Espiroqueta interrogans, Después de 8 años en Japón fue encontrada por los investigadores Inada e Ido 3, nombrada como Espiroqueta icterohemorragica. El riesgo de infección del huésped luego de la interacción con fuentes ambientales depende de la capacidad de leptospira para persistir, sobrevivir e infectar al nuevo huésped para continuar la cadena de transmisión 4, afectando comúnmente a las poblaciones de escasos recursos y resultando en una morbilidad y mortalidad significativas 5, La leptospirosis a menudo se diagnostica erróneamente con otras enfermedades febriles tropicales6.
Leptospira interrogans es una de las principales causas de enfermedades humanas y L. borgpetersenii es una de las principales causas de enfermedades animales7. El período de incubación es de 2 a 30 días y la enfermedad generalmente ocurre de 5 a 14 días después de la exposición8.Las leptospiras colonizan los túbulos proximales renales e infectan crónicamente el riñón. Las bacterias vivas se excretan en la orina, contaminando el medio ambiente 9. La forma más común de diagnosticar la leptospirosis es a través de pruebas serológicas, ya sea la prueba de aglutinación microscópica (MAT), que detecta anticuerpos específicos de serovar, o un ensayo de fase sólida para la detección de anticuerpos de inmunoglobulina M (IgM) 10.
Neospora caninum (N. caninum), un protozoario del filo apicomplexa, se distribuye globalmente e impone pérdidas económicas significativas a los productores y la industria ganadera 11. Los rumiantes se involucran principalmente como huéspedes intermediarios y los caninos como huéspedes definitivos 12 La seroprevalencia informada de exposición a N. caninum en el ganado oscila entre 7,6 y 41 % en las Américas 13,14. La patogenicidad de N. caninum varía según su especie hospedera, el ganado es el huésped más susceptible, el parásito causa abortos, mortinatos, muertes neonatales, pérdida fetal temprana y reabsorción de embriones15,16.
Este parásito puede persistir en granjas y rebaños durante años, y la transmisión congénita, la principal vía de aborto provocada por N. caninum juega un papel fundamental en este sentido.
Hoy en día, se dispone de varias técnicas de diagnóstico para la detección de la infección por N. caninum. En los casos de aborto por Neospora en bovinos, la histopatología y la inmunohistoquímica (IHC) utilizando tejidos de fetos abortados se consideran las pruebas definitivas 17 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se utiliza para la determinación de ácidos nucleicos específicos de parásitos en muestras de animales abortados, como cerebros y placenta 18.
Todas las especies de mamíferos son potencialmente huéspedes accidentales de la leptospirosis y no se ha identificado ninguna especie como refractaria a la infección. Actualmente, existen más de 250 serovariedades conocidas de Leptospira spp., las cuales muestran una distribución variable por región geográfica y especie huésped 19. Los parásitos de N. caninum se han cultivado con éxito en líneas celulares humanas, pero se han informado títulos bajos de anticuerpos de especificidad no confirmada contra N. caninum en muestras de suero humano 20,21,22. Seis de cada diez casos humanos de enfermedades infecciosas surgen de la transmisión animal 23 Los objetivos fueron:
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación del estudio.
El estudio en referencia se realizó en Unidades de Producción Agropecuarias UPAs (más de 500m²) de las parroquias Jimbilla, Chuquiribamba, Chantaco, Gualel, El Cisne, Vilcabamba, San Pedro de Vilcabamba, Malacatos, Quinara, San Sebastián, Sucre, El Sagrario, El Valle, pertenecientes a la zona urbana y rural del cantón Loja, que se encuentran entre los 1478 y 2880 msnm., presenta una precipitación por la variación de las isoyetas de 400 a 900 mm/año, la temperatura en base al trazo de las isotermas del cantón es de 10°C a 22°C.23.
Se seleccionaron hembras bovinas comprendidas en edad reproductiva de más de un año de edad, en las que se han evidenciado o no abortos u otros problemas relativos a la reproducción, para el estudio no se consideraron machos de ninguna edad.
Se tomaron 956 muestras de sangre de 158 UPAs áreas urbanas y rurales del cantón Loja, por punción de la arteria coccígea media, se recolectó en tubos vacutainers de 10 mL., tapa roja sin anticoagulante previamente rotulados, se transportaron en cooleres, sin ser expuestos directamente al hielo, en el laboratorio se registraron y codificaron en las matrices internas, el procesamiento se realizó mediante centrifugación a 3000 rpm., por el lapso de cinco minutos, el suero sanguíneo obtenido fue alicuotado en tubos Eppendorf de 0,5 mL., se conservaron a -20 ºC., hasta el inicio de las pruebas, para el examen coproparasitario se tomaron 40 muestras de caninos de igual cantidad de ganaderías que resultaron seropositivas a N. caninum.
Ejecución de pruebas. La detección de la presencia de anticuerpos leptospirales se realizó a través de la prueba de Aglutinación Microscópica en Tubo (MAT) que utiliza diluciones seriadas del suero que se expone a igual volumen de suspensión de leptospiras vivas, se utilizaron serovariedades vivas de Leptospira spp., veinticuatro que se corresponde a patógenas y una de comportamiento saprofítico, para la interpretación de resultados se consideraron positivas las muestras que alcancen títulos iguales o superiores a 1 en 100 o más junto con signos clínicos, positivas si alcanza títulos superiores a 1 en 400 o cuando aumentan la titulación en la muestra pareada tomada entre los 14 y 21 días hasta cuatro o más veces sus títulos. Las pruebas se ejecutaron en los laboratorios del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI Quito y Guayaquil). Las biovariedades patógenas que se utilizaron fueron las clasificadas en L. interrogans y como control fue utilizada la biovariedad no patógena L. patoc.
La detección de anticuerpos a Neospora caninum se realizó mediante el kit de la casa VMRD Veterinary Medical research and development. 425 NW Albion Drive Pullman, WA 99163, (cELISA) considerando el protocolo del fabricante.
La detección de ooquistes en muestras de heces de perros utilizó el método rutinario para carnívoros de Teleman, en el cual se procesaron cerca de 5 g de heces por animal, se realizó flotación con solución de sacarosa, las muestras se examinaron con un microscopio óptico utilizando el objetivo 400.
Análisis estadístico.
La seroprevalencia y los intervalos al 95% de confianza se calcularon para las veinte y cinco biovariedades de Leptospira. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para analizar las asociaciones entre la seropositividad de Leptospira spp., N. caninum y las parroquias del cantón Loja, así como también para evaluar la relación entre los títulos de anticuerpos específicos y las diferentes serovariedades de Leptospira. Cuando las condiciones para aplicar la prueba Chi-cuadrado no fueron adecuadas, el valor p se aproximó a partir de simulaciones de Monte Carlo 18 con 10000 permutaciones. Las pruebas estadísticas se realizaron con el programa estadístico R versión 4.0.3 19. Se aplicó regresión logística para desarrollar el modelo predictivo de la seropostividad de Leptospiras y Neosporas en función de las parroquias urbanas y rurales del cantón Loja. Para las parroquias que presentaron significación estadística (p < 0.05) se determinó la razón de probabilidad (Odds-ratio) con el respectivo intervalo de confianza. Para esto se utilizó la librería “oddsratio” del programa R.
RESULTADOS
Seroprevalencia a leptospirosis y neosporosis bovina en el Cantón Loja.
La prueba de MAT para las 956 muestras mostró una seroprevalencia a leptospirosis en el 74.83% de los casos, con títulos iguales o superiores a 1/100, la prueba de cELISA para la detección de anticuerpos anti N. caninum mostró una seroprevalencia del 19,35% ; la seroprevalencia para las dos enfermedades es del 19.17%.
Tabla 1 Seroprevalencia a Leptospira spp., y Neospora caninum y a las dos enfermedades en ganado bovino del cantón Loja
Los resultados nos muestran una mayor seroprevalencia de Leptospira spp., con relación a Neospora caninum sin embargo, luego de evaluar la relación entre la seroprevalencia de Leptospira spp., y Neospora caninum y las diferentes parroquias del cantón Loja, no se evidenció relación significativa (X-squared = 20.314, p = 0.9131); es decir la proporción de seroprevalencia de leptospira y neospora se distribuye de forma similar en todas las parroquias.
Figura 1 Seroprevalencia a Leptospira spp y Neospora caninum., en bovinos de parroquias urbanas y rurales del cantón Loja
Al evaluar el riesgo de presencia de Neosporas y Leptospiras se encontró que las parroquias urbanas de San Sebastián y la rural de Jimbilla fueron significativamente diferentes al resto de parroquias (Tabla 1).
Tabla 2 Factor de riesgo que afecta la seroprevalencia de Leptospiras y Neosporas en el cantón Loja, estimado mediante regresión logística. OR: odds-ratio, LI: límite inferior, LS: límite superior al 95%.
En la parroquia San Sebastián, la probabilidad de identificar Leptospiras en las muestras es 6.67 veces más que en el resto de parroquias, en Jimbilla el riesgo de encontrar Neosporas fue 21 veces mayor al resto de parroquias, y 13 veces mayor de encontrar simultáneamente Leptospiras y Neosporas (Tabla 2). El resto de lugares que no aparecen en la tabla presentaron estimadores de regresión no significativos.
Se obtuvieron 509 muestras con títulos de 1/100 (71.1%), 650 muestras con títulos de 1/200 (90.9%), 207 muestras con títulos de 1/400 (28.9%) y una muestra con títulos de 1/800 (0.2%), (Figura 2).
La muestra pareada utilizó el 7.4 % de los seroreactores, independientemente de la titulación mostrada (53 muestras) se obtuvieron títulos de 1/200 en el 54% de los casos (29 muestras); cuatro veces en el 28 % (15 muestras) y un 18 % no mostraron incremento de los títulos (9 muestras).
En todas las ganaderías lecheras visitadas se encontraron entre uno a diez perros al interior de la propiedad, al realizar la prueba coprológica de Teleman se determinó la presencia de ooquistes en el 5% de las muestras.
DISCUSIÓN
La leptospirosis tiene una amplia distribución, pero prevalece principalmente en las regiones tropicales y pobres del mundo 24, en la región tropical de la provincia de Manabí, los escasos estudios realizados denotan prevalencias variables, que van del 35.8% al 75% 25, Fuentes et al. 26 encontraron que los casos de leptospirosis en zonas endémicas de enfermedades tropicales con manifestaciones clínicas similares a la leptospirosis eran 26 a 49 veces mayores que los diagnosticados y reportados por los Servicios de Salud, en estudios realizados en zonas rurales del ecuador se registró la positividad en orina de ganado del 35.4 % (n = 17/48), en la misma investigación se tomaron muestras de pacientes febriles sin diarrea o síntomas respiratorios agudos dando positivos para ADN de leptospira patógena en el 17,3 % (n = 78/449) (27). En el estudio se encontró una seroprevalencia en ganado bovino del 74.83%, no se pudieron registrar signos clínicos de la enfermedad en los animales sobre todo en las muestras con títulos de 1/100 y 1/200 por lo que se puede considerar que en algún momento estuvieron en contacto con la bacteria o con la posibilidad de una enfermedad en curso, en cambio se registró una seroprevalencia al análisis de la primera muestra títulos de 1/400 del 28.9% y una muestra con títulos de 1/800 considerándose una infección activa. Siguiendo el protocolo se realizó la prueba a una segunda muestra en la que se determinó el incremento de los títulos 1/400 en el 28% de las muestras confirmando la infección activa, demostrando además que leptospira puede sobrevivir en un medio ambiente de temperatura inferior a lo que se reporta habitualmente.
La parroquia con mayor probabilidad de identificar Leptospiras es San Sebastián, posiblemente al manejo de los animales, ya que estas bacterias se transportan en la orina de animales infectados, como roedores, cerdos, vacas, perros y muchas especies de vida silvestre. Si la orina de un animal infectado se deposita o drena en un cuerpo de agua dulce (lago, río, arroyo, etc.) o suelo, la bacteria puede sobrevivir allí durante semanas o meses 28.
En las últimas dos décadas, N. caninum ha sido ampliamente investigada debido a su importancia como patógeno veterinario. Como resultado de estos estudios ahora se sabe que N. caninum tiene una distribución global y causa enfermedades neuromusculares graves en perros, y aborto y mortalidad neonatal en el ganado 29. En un estudio realizado en dos ganaderías de leche en Ecuador se encontró una alta seroprevalencia para N. caninum (21,5 %) 30, en nuestro estudio se encontró una seroprevalencia del 19,35%. Este patógeno protozoario se mantiene en el medio ambiente mediante un ciclo de vida heterogéneo que involucra un huésped cánido definitivo y una amplia gama de huéspedes intermedios 31, en todas las ganaderías investigadas se encontró perros en su interior que es el principal portador del parásito. Se cree que ocurren tres métodos naturales de transmisión de N. caninum en el ganado: 32 ingestión de ooquistes esporulados del parásito (transmisión horizontal); 33 infección transplacentaria (transmisión vertical) de una madre previamente infectada a su descendencia 34; o (35 transmisión horizontal a una madre preñada seguida de transmisión vertical a su feto (transmisión horizontal y vertical combinada).
CONCLUSIONES
Los títulos de 1:100 o superior frente a uno o más antígenos leptospirales, sólo es evidencia indicativa de la enfermedad en un período anterior o posible enfermedad en curso.
Por los resultados de las muestras pareadas se considera confirmada la enfermedad de leptospirosis bovina cuando aumenta en cuatro o más veces el título de anticuerpos de los reactores investigados a los 14 a 21 días posteriores a la primera prueba en esta investigación se detecta una infección activa del 28%.
La presencia de perros en las ganaderías los convierte a los bovinos en hospedadores intermediarios y contaminados por transmisión horizontal.
La presencia de roedores cerca a los alimentos y fuentes de agua conjuntamente con la forma de crianza de los animales pueden estar incidiendo en los altos porcentajes de seropositividad a leptospirosis.
Mayor riesgo para que los bovinos desarrollen leptospirosis y N.caninum, es la parroquia Jimbilla y San Sebastián para leptospirosis. Estos resultados aportan con información para que las entidades competentes tomen medidas preventivas y se logre romper la cadena de infección.
