Antecedentes de Beauveria bassiana como controladores biológicos.

El entomopatógeno B. bassiana se observó por primera ocasión en los gusanos de seda, donde las larvas tenían una cubierta de color blanco en el exterior con múltiples inflorescencias que podían contagiar a las larvas sanas en un corto periodo de tiempo (Bassi, ¹⁸³⁵). En el año 1954, se reportaron los primeros brotes de infección en acrídidos, pero fue en el año de 1987 cuando se comprobó la patogenicidad del microorganismo en saltamontes bajo condiciones de laboratorio (Inglis, Goettel y Johnson, ¹⁹⁹³).

En los últimos años se han descubierto alrededor de 700 especies de insectos hospederos del patógeno B. bassiana (Xiao y col., ²⁰¹²). Este hongo tiene la capacidad de infectar a los principales taxones de insectos cuando encuentra las condiciones adecuadas para inocular el huésped. Sin embargo, los estudios relacionados con la patogenicidad de B. bassiana se han centrado en los insectos considerados plagas (Meyling y Eilenberg, ²⁰⁰⁷). La secuencia del genoma de huéspedes infectados demostró que B. bassiana evolucionó a partir de insectos; también se asume que la expresión de ciertos genes de tipo proteasas y quitinasas están asociadas a las funciones necesarias para la patogénesis de insectos y la evolución convergente (Xiao y col., ).

Potencial bioplaguicida de Beauveria bassiana.

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno utilizado como controlador biológico en plagas de cultivos agrícolas (Barcenilla, ²⁰²¹). El patógeno ingresa en los insectos a través de los conidios que se adhieren a la cutícula del huésped. La formación del tubo germinativo y el apresorio permite la fijación al tegumento del insecto por presión. La acción de las enzimas hidrolíticas de tipo lipasas, proteasas y quitinasas ingresan al cuerpo del insecto por las partes blandas (Lara-Juache y col., ²⁰²¹). Las hifas tienen contacto con la hemolinfa que contiene altos contenidos de nutrientes, iniciando una etapa de gemación de blastosporas unicelulares (Mascarin y Jaronski, ²⁰¹⁶). El hongo coloniza los tejidos internos del insecto y durante este proceso liberan metabolitos como beauvericina y bassiacridin que ayudan a inhibir el sistema inmunológico, facilitando el ingreso hacia los órganos internos del huésped y provocando su muerte (Figura 1) (Harith-Fadzilah, Abd Ghani y Hassan, ²⁰²¹). Los insectos infectados muestran una cubierta algodonosa y polvorienta de coloración amarilla cremosa que recubre la parte externa del huésped (Barcenilla, ).

En la etapa de colonización, B. bassiana secreta proteínas y enzimas que pueden ser utilizadas como fábricas celulares para la producción de insumos comerciales. La evaluación de la actividad metabólica, por secuenciación completa del genoma, expresa que B. bassiana posee un pangenoma abierto, con capacidad para colonizar diferentes huéspedes (insectos, nematodos y plantas). Además, se identificaron 10366 genes que codifican para proteínas como proteasas y 145 enzimas activas de carbohidratos de tipo quitinasas, celulasas y hemicelulasas (Vidal y Jaber, ²⁰¹⁵).

Figura 1 Proceso de infección de Beauveria bassiana en la cutícula de los insectos. (a) Estructuras de B. bassiana (b) Diseminación de conidios B. bassiana. (c) Formación del tubo germinativo en la superficie del cuerpo del insecto. (d) Formación del apresorio e ingreso de la hifa en la procutícula y epidermis. (e) Producción de Blastosporas e invasión en hemocele. (f) Liberación de metabolitos secundarios. (g) Formación de las estructuras del hongo (hifas, micelio y conidios) y liberación al espacio exterior. 

La expresión génica de B. bassiana en el proceso de inoculación de insectos demuestran la presencia de enzimas peroxidasas, trehalasa, lipasa, peptidasa, fosfatasa y liasa responsables de la degradación de la cutícula de los huéspedes. Las enzimas quitinasas de B. bassiana hidrolizan los enlaces b de polímeros de quitina en monómeros de N-acetil b-D-glucosamina presentes en el exoesqueleto de artrópodos (Amobonye y col., ²⁰²⁰). La cutícula de los insectos está formada por lípidos superficiales que actúan como una barrera protectora de patógenos. Sin embargo, las lipasas producidas por B. bassiana contribuyen a la degradación de la cutícula del insecto (Salazar y col., ²⁰²⁰); estas son enzimas solubles en agua que actúan sobre sustratos insolubles que tienen la capacidad de hidrolizar triglicéridos y transformarlos a ácidos grasos y glicerol. Las proteasas entomopatógenas actúan sobre la cutícula del huésped y atacan el tejido debilitado por acciones quitinolíticas (Amobonye y col., ).

La diversidad de toxinas producidas por B. bassiana puede ir desde compuestos simples como las macromoléculas biológicas, por ejemplo, ácido oxálico, 2,6piridindicarboxílico (ácido dipicolínico), y compuestos de estructuras más complejas de naturaleza peptídica cíclica y lineal como beauvericina, bassiacridina, beauverólidos y bassianólidos (Borges y col., ²⁰¹⁰). Las toxinas alteran la permeabilidad natural y artificial de las membranas, inducen la pérdida de líquidos de las células, producen cambios en el núcleo durante los procesos de la muda y metamorfosis, deforman las estructuras externas de los insectos e interfieren en los procesos de fecundación (Patocˇka, ²⁰¹⁶). Por último, las enzimas lipasas, quitinasas, proteasas y amilasas degradan el exoesqueleto del huésped y permite el ingreso del hongo en sus tejidos internos (Cortés y Mosqueda, ²⁰¹³).

Producción in vitro de Beauveria bassiana

Los procesos de producción de conidios de B. bassiana pueden ir desde métodos muy simples a procesos que implican mayor tecnificación (Vela y col., ²⁰¹⁹). El primer paso para la producción de B. bassiana consiste en realizar aislamiento de las cepas del microorganismo; para ello es importante determinar la composición del medio de cultivo y los parámetros óptimos para el crecimiento. Greenfield y col. (²⁰¹⁶) afirma que las cepas de B. bassiana pueden cultivarse en agar glucosa, peptona de soya, agar papa-dextrosa (PDA), agar de dextrosa-Sabouraud (SDA) o agar harina de avena. Las temperaturas óptimas para el crecimiento van desde 22-26 ◦C, alternando luz y oscuridad por ocho días.

En cambio, Bugti y col. (²⁰¹⁸) manifiestan que se debe realizar una suspensión de esporas del microorganismo e inocular el medio de cultivo agar dextrosa-Sabouraud (agar 20 g, peptona 10 g, dextrosa 40 g, potasio 0.5 mg, en 1000 mL de agua destilada) e incubar a 24 ± 1 ◦C por doce días.

El segundo paso consiste en comprobar la patogenicidad de B. bassiana a través de inoculaciones de insectos sanos. Para ello se debe preparar suspensiones de conidios en una solución de Tween 80 al 0.05 %, con agitación constante por cinco minutos, y ajustar la concentración de esporas y rociar los insectos (Bugti y col., ²⁰¹⁸). En la Tabla 1 se detallan estudios realizados para comprobar la patogénesis de B. bassiana en diferentes huéspedes.

Fermentaciones en sustratos sólidos

La producción de Beauveria bassiana en sustratos sólidos por reproducción de conidios aéreos es el método más utilizado a nivel comercial tanto para pequeñas, medianas y grandes empresas dedicadas a la producción de bioplaguicidas (Feng, Poprawski y Khachatourians, ²⁰⁰⁸). Los medios de cultivo para la producción de B. bassiana deben tener una composición de nutrientes y condiciones controladas de pH, temperatura, luz, disponibilidad de agua y mezcla de gases atmosféricos, pues son factores cruciales para el crecimiento del microorganismo y esporulación (Patocˇka, ²⁰¹⁶). El proceso de producción consiste en inocular conidios de B. bassiana en sustratos sólidos nutritivos. La fermentación en sustratos sólidos bajo condiciones controladas pueden alcanzar rendimientos desde 4 × 1012 a 4 × 1013 conidios·kg−1.

Los materiales más utilizados para la fermentación en estado sólido es el arroz, cebada, trigo, centeno, sorgo y maíz, (Jaronski, ²⁰¹⁴). Así mismo, los desechos agroindustriales permiten reducir los costos de producción y consumo de energía. Un ejemplo de ello es la piel de papa y cáscara de arroz, en condiciones óptimas de humedad 65-70 %, temperatura 25 ◦C y tiempo entre 7 a 8 días, permite alcanzar una producción de 1.3 × 109 esporas·g−1 de B. bassiana (Sala y col., ²⁰²¹).

Tabla 1 Estudios realizados para comprobar la patogénesis de Beauveria bassiana en diferentes hospederos y su porcentaje de mortalidad 

Otro factor importante son los contenedores de fermentación, estos pueden ser bolsas de plásticos resistentes a altas temperaturas o grandes cámaras, considerando la aireación ya que los propágulos requieren de un equilibrado intercambio de gases para el crecimiento micelial. La producción de conidios aéreos se puede realizar a través de una o dos etapas. La primera etapa consiste en realizar la inoculación del hongo directamente del sustrato sólido y la segunda etapa implica la producción del inóculo por fermentación líquida y posterior la inoculación en el sustrato sólido (Mascarin y Jaronski, ²⁰¹⁶).

El sustrato debe estar previamente esterilizado a 121 ◦C, 15 lb de presión por 30 minutos, se inocula el sustrato con la suspensión de conidios de B. bassiana o con una proporción de micelio. Los sustratos inoculados se incuban a 25 ◦C por 7 días y se eliminan los sustratos contaminados (López-Sosa, García-Gómez y Gaona, ²⁰¹⁸). Por consiguiente, las bolsas se agitan para oxigenar el inóculo y conseguir una mezcla homogénea, se incuba por 21 días a 24 ◦C (Monzón, ²⁰⁰¹) conservando una humedad relativa del 53 %. Una vez esporulado el hongo en todo el sustrato, se realiza el proceso de secado a temperaturas entre 16-20 ◦C por un periodo de 5 a 6 días para reducir la humedad relativa al 15 % (Gómez y col., ).

El problema principal de la fermentación sólida es el escalado comercial, siendo el principal enfoque la producción de un gran número de conidios de forma eficiente y económica para reducir los costos de producción y poder competir con los plaguicidas tradicionales (Rodríguez-Gámez y col., ²⁰¹⁷). Por ello es importante utilizar sustratos y recipientes de buena calidad, pero al mismo tiempo económicos; y, además, vigilar de forma constante cada uno de los procesos de producción para evitar contaminaciones, realizando un correcto proceso de esterilización y manipulación de los materiales. Los sustratos y las condiciones ambientales para la fermentación sólida de Beauveria bassiana se muestran en la Tabla 2.

Fermentaciones en sustratos líquidos

El proceso de fermentación líquida facilita el escalado masivo para la formulación de bioplaguicidas. Este método permite tener un mejor control de las variables ambientales y reducir los tiempos de producción (Jaronski, ²⁰¹⁴). Sin embargo, la implementación a escala comercial requiere de una considerable inversión en equipamiento para la producción masiva de micoinsecticidas, y es uno de los métodos más aplicados a escala comercial (Mascarin y Jaronski, ²⁰¹⁶).

La fermentación líquida se puede realizar de forma estacionaria o por fermentación sumergida. La primera produce micelios y conidios aéreos, por el contrario, la segunda opción produce blastosporas, conidios de microciclo, o microesclerocios en un medio líquido agitado y aireado (Jaronski, ²⁰¹⁴). Los medios de cultivo deben ser ricos en nutrientes con altas concentraciones de carbono y nitrógeno para inducir la producción de blastosporas o conidios. Una relación de C:N óptima induce el crecimiento del hongo bajo condiciones controladas (Pham y col., ²⁰⁰⁹).

Según García y col. (²⁰¹³) el medio de cultivo SDA (Sabouraud dextrose agar) proporciona nutrientes adecuados para el desarrollo de B. bassiana en un periodo de incubación de 15 días a 30 ◦C. Así mismo, Pham y col. (²⁰⁰⁹) señalan que los inóculos de conidios para medios de cultivos líquidos se deben obtener a partir de cultivos esporulados de dos semanas de edad en Agar Papa Dextrosa (PDA) a una temperatura de 25 ± 1 ◦C. La cosecha de los conidios se realiza mediante un raspado del inóculo con una solución de tween 80 al 0,02 % (Lee y col., ²⁰¹⁶). Se inoculan los matraces que contiene medio de cultivo líquido con melaza como fuente de carbono (García y col., ), caldo de levadura o glucosa por 6 días a una temperatura de 24-26 ◦C (Lee y col., ) en un agitador rotatorio a 200 rpm hasta conseguir una suspensión estable (Pham y col., ). La suspensión obtenida se utiliza para inocular el fermentador en una concentración del 10 % referente al volumen del fermentador, con una fase de propagación de 4 días hasta que el hongo alcance el 80 % de la fase logarítmica de crecimiento (García y col., ).

Tabla 2 Sustratos utilizados para la fermentación sólida de Beauveria bassiana. 

Los sustratos utilizados para la elaboración de los medios de cultivos líquidos deben ser de bajos costos, y al mismo tiempo deben proporcionar las condiciones adecuadas para la producción de blastosporas o conidios (Mascarin y col., ²⁰¹⁵). En este contexto, Pham y col. (²⁰⁰⁹) comunica que un medio de cultivo con harina de maíz al 3 %, polvo de maceración de maíz 2 % y de salvado de arroz 2 % permite obtener una producción de 8,54 × 108 blastosporas·mL−1. En cambio, García y col. (²⁰¹³) informa que para la producción de blastosporas el medio óptimo debe tener melaza 14,5mL·L−1, (NH₄)2 SO₄ 6 g·L−1, KH₂PO₄ 3,5 g·L−1, MgSO₄ 0,5 g·L−1, NaCl 0,1g·L−1, CaCl₂ 0,1g·L−1, y se puede obtener una producción 8,40 × 108 blastosporas·mL−1. Por otro lado, Elías-Santos y col. (²⁰²¹) informa que un medio de cultivo con 20 g de harina de pericarpio de cacahuate y 200 g de glucosa de maíz permite obtener 5,10 × 108 blastosporas·mL−1.

De igual forma, las condiciones ambientales son importantes para la producción Beauveria bassiana en medios de cultivos sumergidos. El rango de temperatura se sitúa ente los 25-30 ◦C, pH del medio de cultivo 5.4, agitación constante de 200 a 400 rpm, hasta que el hongo pueda alcanzar el 80 % de la fase logarítmica de crecimiento (Pham y col., ²⁰⁰⁹; García y col., ²⁰¹³; Elías-Santos y col., ²⁰²¹). En la Tabla 3 se pueden observar los medios de cultivos y las condiciones ambientales para la producción de B. bassiana por fermentación de sustratos líquidos.

Producción de metabolitos secundarios de Beauveria bassiana

El entomopatógeno Beauveria bassiana secreta una gran variedad de enzimas y metabolitos biológicamente activos (Amobonye y col., ²⁰²⁰), con potenciales de aplicación en los sectores industriales, agrícolas y farmacéuticos, entre otros (MancillasParedes y col., ). Las enzimas más importantes producidas por B. bassiana son las quitinasas, lipasas y proteasas, aunque también producen amilasa, asparaginasa, celulasa, galactosidasa, etc. (Amobonye y col., ); y metabolitos con actividad insecticida (Tabla 4) como beauvericina (Al Khoury, Guillot y Nemer, ²⁰¹⁹), bassiacridin (Quesada-Moraga y Vey, ²⁰⁰⁴), bassianolide (Patocˇka, ²⁰¹⁶), antivirales y antibacteriales como oosporein (Jeffs y Khachatourians, ¹⁹⁹⁷), y bassianin como inhibidor de la ATP (Patocˇka, ). La producción de metabolitos secundarios está influenciada por las condiciones ambientales y nutrientes disponibles en el medio de cultivo (Ávila-Hernández y col., ²⁰²⁰) (Tabla 5).

Tabla 3 Fermentación en sustratos líquidos de Beauveria bassiana. 

Aplicación de bioplaguicidas en la agricultura

El crecimiento poblacional, la degradación del medio ambiente (Thakur y col., ²⁰²⁰), la demanda de cultivos libres de químicos y las estrictas regulaciones de los plaguicidas en países europeos y norte de América (Mascarin y Jaronski, ²⁰¹⁶) representan un desafío para la producción de alimentos en todo el mundo. La agricultura convencional depende de los plaguicidas para el manejo integrado de plagas y enfermedades en los cultivos agrícolas. Una alternativa que contribuye a reducir la incidencia de fitófagos o fitopatógenos son los bioplaguicidas formulados a través de la reproducción de microorganismos benéficos o la producción de metabolitos con actividades insecticidas, fungicidas o bactericida (Tabla 6). Las ventajas que poseen estos formulados es que se degradan de forma natural en el ambiente, no almacenan residuos en los tejidos vegetales, no crean resistencias hacia los activos que producen, y disminuyen la presencia de enemigos naturales en los cultivos (Thakur y col., ).

La creciente aceptación de los productos biológicos ha permitido desarrollar formulaciones a partir de hongos entomopatógenos, por fermentaciones sólidas, líquidas, bifásicas y metabolitos secundarios. En la actualidad, se utilizan con frecuencia en los programas fitosanitarios de los cultivos agrícolas para controlar poblaciones de insectos fitófagos (Luo y col., ²⁰¹⁴). La actividad insecticida de B. bassiana es más rápida en relación con otros microorganismos entomopatógenos, y los conidios pueden persistir por más tiempo en el ambiente. Además, Sabbahi, Merzouki y Guertin (²⁰⁰⁸) afirma que las posibilidades de adquirir resistencia por parte de los insectos hacia B. bassiana es nula, debido a los diferentes modos de acción que el hongo utiliza para invadir el cuerpo de los huéspedes, y al ser un organismo vivo puede adaptarse a los cambios del hospedador.

Tabla 4 Metabolitos secretados por Beauveria bassiana para el control de artrópodos. 

Tabla 5 Medios de cultivos formulados para la producción de metabolitos secundarios de Beauveria bassiana. 

La eficacia del bioplaguicida Beauveria bassiana depende de la integración en los programas de manejo integrado de plagas para potenciar la eficacia en el control de insectos (Mascarin y Jaronski, ²⁰¹⁶). Si bien B. bassiana es un microorganismo eficaz para el control biológico de insectos, las condiciones ambientales juegan un papel importante en el mecanismo de acción del entomopatógeno, por ello resulta indispensable desarrollar nuevas tecnologías para la producción de los compuestos activos, que potencien las formulaciones de biopesticidas.