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INTRODUCCIÓN
Actualmente, existe un crecimiento en la demanda de plantas medicinales, con una aceptación en continuo aumento. El último informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre Medicina Tradicional y Complementaria (MTC) indica que numerosos países en todo el mundo están formulando pautas dirigidas a la efectiva integración de terapias MTC en sus sistemas de atención de salud [1]. Solo una pequeña fracción de la biodiversidad conocida ha sido minuciosamente examinada para comprender sus características y potenciales beneficios para los seres humanos [2]. La significativa diversidad biológica y cultural del Ecuador lo posiciona como un país con un excelente potencial en el campo de la terapia tradicional [3]. En este contexto, es crucial explorar varios aspectos clave, como los métodos de utilización de cada planta y los efectos curativos que la medicina tradicional puede ofrecer a diferentes comunidades del país [4].
La Familia Lamiaceae se considera como la sexta familia de plantas florales más grande, con un aproximado de 7 500 especies, organizadas en 236 géneros, incluyendo todo tipo de plantas herbales, arbustivas y árboles [5]. Tiene una distribución cosmopolita; sin embargo, crece principalmente en el continente americano y en las regiones mediterráneas. En América se encuentran 65 géneros, que se encuentran principalmente en las zonas tropicales de Centroamérica, y en zonas andinas y amazónicas de Sudamérica [6]. Esta familia de especies vegetales cuenta con una gran facilidad de adaptación y cultivo, motivo por el cual, es muy común encontrarlas en estudios etnobotánicos y etnofarmacéuticos que confirman sus aplicaciones medicinales, biológicas, cosméticas e industriales en múltiples culturas y tradiciones del planeta. Históricamente, las plantas de esta familia han sido reportadas para el tratamiento de una serie de condiciones como alergias cutáneas, asma, cansancio, depresión, problemas gastrointestinales, fiebre, entre otros [7]. La Organización Mundial de la Salud, considera que el uso de algunas especies representativas de esta familia, cuyas actividades biológicas y efectos terapéuticos han sido confirmados, deben ser tomadas en cuenta para el tratamiento de nuevas y diferentes enfermedades [8].
A lo largo de la historia, varias especies de plantas han sido empleadas con fines medicinales debido a sus propiedades bioactivas. Desde tiempos antiguos, han sido utilizadas para curar heridas, tratar enfermedades, infecciones, entre otras aplicaciones [9]. La investigación científica ha realizado numerosos estudios enfocados en estas especies vegetales, identificando componentes bioquímicos que contribuyen al mejoramiento del metabolismo humano [10]. La medicina natural se basa en el uso de especies vegetales como fitofármacos, destacando su menor costo y menor toxicidad en comparación con los productos químicos farmacéuticos [11]. Esta preferencia por elementos derivados de plantas con contenido bioactivo se atribuye a su capacidad para mejorar el metabolismo humano, aprovechando su potencial nutricional [12].
Ciertas especies de Clinopodium han sido empleadas como cataplasmas para aliviar el dolor nervioso ciático, mientras que otras tienen efectos psíquicos, utilizándose para tratar histeria, melancolía y trastornos digestivos asociados con el proceso digestivo [13]. La especie Clinopodium tomentosum (Kunth), derivada de las palabras griegas klino (cama) y podion (pequeño pie), comúnmente conocida como menta lanuda, calaminta o Pumin, es una planta herbácea perenne perteneciente a la familia Lamiaceae. Es nativa de Europa, incluyendo regiones como el Mediterráneo y los Balcanes, y en América Latina, prospera en altitudes entre 3 000 y 4 000 metros sobre el nivel del mar [14]. Esta especie prefiere suelos bien drenados y pleno sol o sombra parcial, es tolerante a la sequía y, una vez adaptada, puede crecer en suelos arenosos y arcillosos. Se caracteriza por pequeñas flores tubulares amarillas agrupadas en densos verticilos en la parte superior de los tallos, alcanzando una altura entre 30-80 cm, con hojas peludas de color verde grisáceo que son ovaladas o lanceoladas, cubiertas de pelos finos (tomento), de ahí el nombre ”tomentoso” [15].
Ecuador se destaca por su extensa biodiversidad, con más de 17 000 especies de plantas identificadas, más de 3 000 de las cuales son medicinales y ampliamente utilizadas en varias culturas con fines curativos. Es notable que la legislación actual en este país sudamericano promueva la integración de la medicina indígena en los servicios de salud [16]. Sin embargo, la mayoría de las plantas medicinales utilizadas en la medicina tradicional aún no han sido sometidas a rigurosas evaluaciones científicas [17]. Existe una falta de regulación en su uso, así como limitaciones en la información sobre dosis efectivas, rutas de administración y posibles efectos adversos, subrayando la necesidad de identificar prácticas más seguras, efectivas y basadas en evidencia para su utilización [18].
La familia Lamiaceae engloba numerosas plantas aromáticas encontradas en diferentes regiones del mundo y ha sido estudiada por su potencial en aplicaciones biológicas y médicas [19]. En la medicina popular ecuatoriana existen más de 50 especies de esta familia utilizadas para tratar diversas dolencias [20]. Dentro de esta familia, el género Clinopodium está ampliamente distribuido en el sur y sureste de Europa, Asia y las Américas, lo que lleva a la utilización de muchas de sus especies como plantas medicinales [21]. Estudios fitoquímicos previos en plantas de este género han revelado la presencia de varios compuestos, incluyendo flavonoides, fenilpropanoides, diterpenos, saponinas triterpenoides, así como aceites volátiles y grasas, que exhiben diversas actividades biológicas [22]. Siete especies de Clinopodium son endémicas de Ecuador y se distribuyen en la región central del país, donde se utilizan, aunque no exclusivamente, por sus propiedades medicinales [23].
Actualmente, no se ha realizado ninguna investigación sobre la actividad antiinflamatoria de Clinopodium tomentosum. Sin embargo, estudios previos sobre el distintivo olor de esta planta sugieren propiedades antioxidantes, antibacterianas, sedantes, antiinflamatorias y antifúngicas. También se utiliza en la industria alimentaria como especia para mejorar el sabor de los productos procesados [24] identificaron compuestos fenólicos, descubriendo un nuevo compuesto, el ácido 2-O-benzoil-3-O-tartárico-cinamoilo. A pesar del uso tradicional de C. tomentosum por sus propiedades medicinales y aromáticas, existe una falta de información específica sobre la identificación y caracterización de los componentes bioactivos presentes en esta planta, lo cual es fundamental para comprender su potencial curativo y realizar más estudios [25]. El conocimiento de los componentes bioactivos ha permitido la identificación de compuestos fitoquímicos y sus beneficios en el metabolismo humano, considerando los usos tradicionales y ancestrales de esta especie vegetal, en función a este antecedente se plantea como objetivo determinar la actividad antioxidante y composición del C. tomentosum en extracción húmeda y seca.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación: Este estudio fue realizado en los laboratorios de Química y Bromatología de la Universidad Estatal Amazónica, cantón Pastaza, provincia de Pastaza, en el Km 2 ½ de la carretera Puyo-Tena. Se ubica en las coordenadas Longitud: -78.0025700 Latitud: -1.4836900.
Tipo de investigación: Este artículo se enfoca en investigaciones experimentales dirigidas a verificar la limitada información disponible sobre esta especie en los artículos científicos en nuestro país. Además, se realizó un análisis cuantitativo, que involucró cálculos numéricos del comportamiento polifenólico y antioxidante. El enfoque utilizado es exploratorio, dado que la literatura existente carece de procedimientos detallados para la utilización de los principios activos. En consecuencia, este tipo de investigación es fundamental para generar resultados confiables que puedan respaldar la línea exploratoria de investigación.
Materiales: Esta especie es endémica de los Andes Ecuatorianos y fue recolectada en la región alta del cantón Riobamba, específicamente se tomaron muestras de flores y hojas, elementos esenciales para el estudio.
Método: Se recolectó varias ramas de un arbusto herbáceo o perenne aromático. Posteriormente, se extrajeron las hojas lanceoladas en su estado húmedo. Estas hojas son de color verde grisáceo, cubiertas con tricomas de aproximadamente 1 cm de largo (Fig 1.), y emiten un aroma similar al de la menta, utilizada en la preparación de aguas aromáticas. El período de floración es de marzo a agosto. Esta especie es originaria de Ecuador y prospera en altitudes entre 1 000 y 3 500 metros. La recolección de hojas se inició después de 365 días/1 año de vida de las plantas. Alguna herramienta de identificación de género y sobre todo especie no se menciona. El proceso de deshidratación implicó la recolección de 30 g de hojas Clinopodium. tomentosum, seguido por el secado en un horno a 40°C durante 12 horas. Al volver a pesar, se obtuvo 11 g de material vegetal seco.
El proceso de deshidratación implicó la recolección de 30 g de hojas Clinopodium. tomentosum, seguido por el secado en un horno a 40°C durante 12 horas. Al volver a pesar, se obtuvo 11 g de material vegetal seco.
Extracción de Principios Activos
Se empleó hojas de Clinopodium. Tomentosum en dos condiciones diferentes (húmedas y secas) para la obtención de extractos. En el caso de las hojas de la muestra seca, estas fueron sometidas a un proceso de secado en horno a una temperatura de 40°C durante 12 horas. Esta técnica se aplicó con el propósito específico de facilitar la posterior evaluación del comportamiento antioxidante y polifenólico de los extractos obtenidos.
El método utilizado para obtener el extracto de la planta que se realizó por Extracción Asistida por Ultrasonido (UEA) utilizando un equipo de ultrasonido de la marca Branson Ultrasónicos, proveniente de EE.UU. Para llevar a cabo la extracción de los principios activos, se utilizó una mezcla de metanol y agua en una proporción de 9 partes de metanol por 1 parte de agua, con una relación disolvente-muestra de 100 ml por cada 10 g de muestra obtenida.
El proceso de extracción se desarrolló a una temperatura de 50°C durante 30 minutos, seguido de la filtración de la mezcla para obtener el extracto acuoso. Posteriormente, se protegió este extracto de la luz utilizando papel de aluminio como medida para preservar sus propiedades y evitar posibles alteraciones. Este proceso de extracción mediante la UEA permite obtener un extracto concentrado y de calidad, rico en principios activos que pueden ser de interés para su aplicación en diversas investigaciones relacionadas con las propiedades antioxidantes y polifenólicas.
Determinación de polifenoles totales
Se determinó el contenido total de polifenoles utilizando una curva de calibración basada en ácido gálico, expresando la concentración de polifenoles totales en miligramos de ácido gálico equivalentes por cada 10 gramos de hojas en peso seco.
Para la preparación de la solución de prueba, se tomó 1 ml de la muestra y se diluyó con agua destilada hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Posteriormente, se añadió 0,5 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu, previamente diluido con agua destilada, y la mezcla se dejó reposar durante 10 minutos.
A continuación, se incorporó 0,5 ml de carbonato de sodio al 20 % y se completó el matraz hasta la marca con agua destilada. La solución se agitó y se protegió de la luz utilizando papel de aluminio, dejándola reposar durante 2 horas a temperatura ambiente (20°C) para permitir la reacción química adecuada.
Finalmente, se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis para medir la absorbancia de la solución a una longitud de onda de 765 nm, lo que permitió determinar de manera precisa la concentración de polifenoles totales en la muestra analizada. Este método proporciona una evaluación cuantitativa confiable del contenido de polifenoles, siendo un paso importante en el análisis de las propiedades antioxidantes y bioactivas de los compuestos presentes en las hojas de interés.
Determinación de la Actividad Antioxidante
El método FRAP (Poder Antioxidante de Reducción de Iones Férricos) se basa en la medición de la reducción de 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incolora a un complejo ferroso coloreado, según lo descrito por Benzie en 1996. Para calibrar el método, se utilizó un estándar de TROLOX.
Para preparar las muestras, se realizó una dilución de 1:25 v/v con metanol y se analizó de manera inmediata. Posteriormente, se tomó una cantidad específica de esta dilución de muestra (40 µL) y se colocó en un matraz de 10 ml, al cual se le añadieron 5 ml de la solución FRAP.
El matraz se llenó hasta la marca con agua destilada y se dejó reposar en un horno a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Durante este tiempo, se registró la absorbancia de la solución a una longitud de onda de 593 nm. Este proceso permite evaluar el poder antioxidante de la muestra mediante la medida de su capacidad para reducir el complejo ferroso TPTZ, proporcionando información valiosa sobre su actividad antioxidante en términos de equivalente de TROLOX.
Análisis de Espectrometría de Masas de Gases (GC/MS)
La muestra analizada por GC/MS se preparó disolviendo 10 µL de aceite básico en 1 ml de diclorometano y el volumen de inyección fue de 2 µL. El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo, utilizando helio como gas portador a una tasa de flujo de 1 ml/min con una división de 1:50. La programación del horno se muestra en la Tabla 1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Absorbancia por el método Folin y FRAP
En la Tabla 2 se presentan los resultados de absorbancia obtenidos utilizando el método de Folín para evaluar la actividad polifenólica y el método FRAP para calcular la actividad antioxidante en hojas secas y húmedas de Clinopodium tomentosum. Se observa una mínima diferencia en la absorbancia entre los métodos aplicados a las muestras secas y húmedas. Esta ligera variación se atribuye a la pérdida de humedad durante el tratamiento térmico de las hojas.
Estos resultados muestran que tanto las extracciones en estado húmedo como en estado seco produjeron compuestos antioxidantes y polifenólicos. Sin embargo, se observó una diferencia significativa en el contenido entre las muestras, como se detalla en la Tabla 3. Esta disparidad puede atribuirse al contenido de agua presente en las hojas durante el proceso de extracción, lo cual facilita la liberación y solubilización de los fitoquímicos presentes en la planta.
Fig 2 La actividad polifenólica total, expresada en miligramos de ácido gálico equivalente por litro (mg galato Ácido Equivalente. L-1), y la actividad antioxidante total, expresada en miligramos de equivalente de Trolox por litro (mg Trolox Equivalente. L-1), fueron determinadas según los métodos del Folin-Ciocalteau y FRAP respectivamente.
Por otro lado, en la extracción en seco, se observó una mayor concentración de ciertos polifenoles (Fig 2.). La evidencia sugiere que la recuperación de compuestos bioactivos obtenidos en el extracto está altamente influenciada por el tipo de compuesto fenólico y la polaridad del solvente de extracción [26]. Este factor es crucial en el tratamiento de la muestra, ya que estudios previos indican que tanto la extracción de polifenoles como su contenido dependen de la polaridad del solvente utilizado [27]. Por esta razón, se recomienda el uso de disolventes como metanol, etanol, acetona y agua para estos procesos, como sugiere Almendariz (2018) [28]. Esto se relaciona con el estudio llevado a cabo por Sánchez (2016) [29] sobre la extracción de polifenoles y antioxidantes en muestras secas y húmedas, donde se identificó un óptimo parámetro de extracción en la muestra seca asistida por ultrasonido. En varios estudios, se ha observado que el metanol logra una mayor concentración de polifenoles en sus extractos en comparación con otros solventes, lo que resulta en una mayor capacidad antioxidante. Esto lo convierte en uno de los solventes más comúnmente utilizados en experimentos destinados a extraer y maximizar una mayor cantidad de compuestos bioactivos [30].
La cuantificación de polifenoles totales en la especie según el estudio de Zafra (2023) [31] indica un contenido de 633,50 mg EAG/L en fresco y 421,85 mg EAG/L en seco y el contenido de antioxidantes de 9,17 mM trolox/ L en fresco y 17,50 mM trolox/ L en seco. Los contenidos encontrados en la especie de betacarotenos y el ácido ascórbico desempeñan roles dinámicos en la desaceleración del envejecimiento, la reducción de la inflamación y la disminución de ciertos tipos de cáncer [32]. En esta experimentación, se caracterizaron los compuestos polifenólicos y la capacidad antioxidante de las hojas de C. tomentosum [33]. La extracción en estado húmedo puede resultar en extractos con una menor actividad antioxidante y polifenólica en comparación con la extracción en seco, lo que puede proporcionar una mayor producción de extracto [34].
Composición química de Clinopodium tomentosum
Se identificó los compuestos de la especie vegetal mediante cromatografía de gases y se detallan en la Tabla 4 los resultados.
Los constituyentes importantes del aceite básico encontrados en las hojas son la transpiperitona epóxido, que representa el 41,72%, y el óxido de piperitenona, que comprende el 49,3%. Investigaciones previas han identificado varios compuestos importantes en el aceite básico de C. tomentosum. En un estudio realizado por Silva (2022) [35] se reconoció al isomenthone como el componente principal, constituyendo el 41,72%, seguido de la pulegona con el 29,94%, hallazgo coherente con la investigación de [36], donde el isomenthone fue determinado como el componente principal en un 48,4%, con la pulegona como el segundo componente más importante en un 34,3%.
CONCLUSIONES
La caracterización detallada de Clinopodium tomentosum ha proporcionado información crucial para lograr una óptima extracción de sus compuestos. Al analizar el contenido antioxidante y polifenólico utilizando los métodos de Folín-Ciocalteau y FRAP, se concluyó que la aplicación de ultrasonido a la muestra seca resulta en un rendimiento mejorado. Con base en la composición química, dos elementos fueron identificados como los más significativos: la trans-piperitona epóxido y el óxido de piperitenona, ambos pertenecientes al grupo de éteres cíclicos oxigenados y derivados de la piperitona.
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